Estresse oxidativo renal em ratos submetidos à hiper-homocisteinemia

Abstract

O estresse oxidativo tem sido considerado parte importante na etiopatogenia das alterações cardiovasculares e cerebrais causadas pela hiper-homocisteinemia (HHcy), uma condição caracterizada por elevados níveis plasmáticos de homocisteína (Hcy), um aminoácido derivado da metionina. A HHcy leve ocorre quando os níveis plasmáticos de Hcy variam de 15 a 30 µmol/L e pode resultar da deficiência de ácido fólico, vitamina B6 e/ou vitamina B12. A HHcy severa é caracterizada por níveis plasmáticos de Hcy superiores a 100 µmol/L e é encontrada na homocistinúria (HCU) clássica, um erro inato do metabolismo caracterizado pela deficiência da enzima cistationina β-sinatse (CBS), que catalisa a via de transulfuração da Hcy. Visto que estudos mais recentes demonstram que a HHcy também está associada a um comprometimento da função renal, a hipótese deste trabalho é que o estresse oxidativo também esteja envolvido nas alterações renais causadas pela Hcy. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi investigar o efeito da administração de Hcy sobre a formação de espécies reativas de oxigênio (ERO), lipoperoxidação, dano às proteínas e formação de óxido nítrico (NO), além de avaliar as defesas antioxidantes enzimáticas e não enzimáticas em rins de ratos. Visando testar a hipótese de que as possíveis mudanças no status oxidativo/nitrativo nos rins de ratos hiperhomocisteinêmicos poderiam levar à nefropatia, também se verificaram parâmetros séricos de função renal, tais como creatinina, uréia, ácido úrico e albumina. Ratos Wistar foram submetidos a modelos experimentais de HHcy leve e severa desenvolvidos em nosso grupo de pesquisa. No modelo experimental de HHcy leve crônica, ratos adultos receberam injeções subcutâneas diárias de Hcy do 30º ao 60º dia de vida. A dose utilizada foi de 0,03 µmol Hcy/g de peso corporal e induzia concentrações plasmáticas de Hcy d No modelo experimental de HHcy severa crônica, ratos neonatos receberam injeções subcutâneas diárias de Hcy do 6o ao 28o dia de vida. As doses utilizadas foram de 0,3 a 0,6 µmol Hcy/g de peso corporal e elevavam as concentrações plasmáticas de Hcy para cerca de 500μM. O grupo controle recebeu salina e os animais foram decapitados 1 ou 12 horas após a última injeção. Os resultados obtidos a partir do modelo de HHcy leve demonstram que a administração crônica de Hcy aumentou as atividades das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT) e a produção de NO (medida através dos níveis de nitritos) nos rins, assim como reduziu os níveis de albumina no soro dos animais 12 horas após a última injeção. A indução de HHcy leve aguda aumentou os níveis de diclorofluoresceína (DCF) e de nitritos em rins de ratos 1 hora após a injeção. Os resultados do modelo de HHcy severa crônica mostram um aumento significativo dos níveis de DCF e de substância reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) 1 e 12 horas após a última injeção, sugerindo que a Hcy aumentou os níveis de ERO e a lipoperoxidação em rins de ratos, respectivamente. O aumento da atividade da SOD e a redução da atividade da CAT também foram observados em 1 e 12 horas. Por outro lado, a redução das defesas antioxidantes não enzimáticas e o aumento dos níveis de nitritos foram observados somente 1 hora após a última administração de Hcy. A administração crônica de altas doses do aminoácido ainda elevou os níveis de uréia e reduziu os níveis de albumina 12 horas após a última injeção. Tais achados demonstram uma ligação entre a HHcy leve e severa e o estresse oxidativo em rins, o que pode representar, pelo menos em parte, um dos importantes mecanismos que contribuem para o risco de dano renal durante a HHcy.

Oxidative stress has been considered an important part in the etiopathogenesis of cardiovascular and brain changes caused by hyperhomocysteinemia (HHcy), a condition characterized by elevated plasma levels of homocysteine (Hcy), an amino acid derived from methionine. Mild HHcy occurs when Hcy plasma levels range from 15 to 30 µmol/L and may result from deficiency of folic acid, vitamin B6 and/or vitamin B12. Severe HHcy is characterized by plasma Hcy levels above 100 µmol/L and is found in classical homocystinuria (HCU), an inborn error of metabolism characterized by a deficiency of the enzyme cystathionine β-sinatse (CBS), which catalyzes the Hcy transsulfuration pathway. Since recent studies demonstrate that HHcy is also associated with impaired renal function, the hypothesis of this study is that oxidative stress is also involved in the renal changes caused by Hcy. Thus, the aim of this study was to investigate the effect of Hcy administration on the formation of reactive oxygen species (ROS), lipid peroxidation, protein damage and formation of nitric oxide (NO), in addition to evaluating the enzymatic and nonenzymatic antioxidant defenses in rat kidneys. To test the hypothesis that possible changes in oxidative/nitrative status in kidneys of hyperhomocysteinemic rats could lead to renal failure, serum parameters of renal function (creatinine, urea, uric acid and albumin) were also tested. Rats were subjected to experimental models of mild and severe HHcy developed in our research group. In the experimental model of chronic mild HHcy, adult rats received daily subcutaneous injection of Hcy from the 30th to the 60th day-of-age. The dose was 0.03 µmol Hcy/g body weight and induced plasma Hcy levels of about 30μM. The control group received saline and the animals were decapitated 12 hours after the last injection. An experimental model of acute mild HHcy was also performed and was induced by a single subcut. The doses used were 0.3 to 0.6 µmol Hcy/g body weight and elevated plasma concentrations of Hcy to about 500μM. The control group received saline and the animals were decapitated 1 or 12 hours after the last injection. The results obtained from the model of mild HHcy demonstrate that chronic Hcy administration increased superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activities and NO production (measured as nitrite levels) in kidneys, as well as reduced serum albumin levels at 12 hours after the last injection. Induction of acute mild HHcy increased dichlorofluorescein (DCF) and nitrite levels in rat kidneys at 1 hour after injection. The results of the model of chronic severe HHcy show a significant increase in DCF and thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) levels at 1 and 12 hours after the last injection, suggesting that Hcy increased ROS levels and lipid peroxidation in rat kidneys, respectively. The increase in SOD activity and the reduction in CAT activity were also observed at 1 and 12 hours. Moreover, the reduction of nonenzymatic antioxidant defenses and increase in nitrite levels were only observed at 1 hour after the last administration of Hcy. The chronic administration of high doses of the amino acid still increased urea levels and decreased albumin levels at 12 hours after the last injection. These findings demonstrate a link between severe and mild HHcy and oxidative stress in the kidneys, which may represent, at least in part, one of the important mechanisms that contribute to the risk of kidney damage during HHcy.