Estudo da expressão gênica das ectonucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (e-ntpdases) em trichomonas vagilalis e participação da sinalização purinérgica na relação parasito-hospedeiro

Abstract

Introdução: Trichomonas vaginalis é um protozoário extracelular, agente etiológico da tricomonose, a mais prevalente doença sexualmente transmissível (DST) não viral no mundo. A citoaderência tem sido um dos mecanismos de patogenicidade mais estudados, porém, pouco se avaliou sobre a adesão do T. vaginalis a superfícies abióticas e, até o presente momento, não foi determinado se o T. vaginalis adere a dispositivos intrauterinos (DIU) e ao anel vaginal. Objetivos: (i) avaliar a capacidade de adesão do T. vaginalis às diferentes superfícies abióticas e estudar os mecanismos envolvidos nesse processo; (ii) comparar os mecanismos envolvidos na citoaderência com os de adesão a superfícies abióticas. No decorrer do estudo, ficou evidenciada a necessidade de inclusão de dois objetivos: (a) uma revisão sistemática da literatura científica para determinar as estimativas de prevalência e incidência da tricomonose no mundo; (b) determinar a estabilidade de genes candidatos a genes de referência para a utilização como housekeeping genes nos ensaios de expressão gênica. Métodos: Foi realizada uma revisão sistemática, seguindo as normas do PRISMA guidelines, para avaliar números atuais de prevalência e incidência da tricomonose no mundo. Com relação à estabilidade de genes candidatos a genes de referência, nove tiveram seus níveis de expressão constitutiva avaliados quando cultivados sob limitação e suplementação de nutrientes. Trinta e dois isolados de T. vaginalis foram avaliados quanto à capacidade de adesão ao plástico, pelo método de cristal violeta em placas de poliestireno. Na sequência, foram selecionados, aleatoriamente, dois isolados que apresentaram forte adesão ao plástico para serem utilizados como modelo de estudo dos mecanismos de citoaderência às células epiteliais vaginais (CEVs) e adesão às superfícies abióticas (DIU e anel vaginal). Os isolados de T. vaginalis TV-LACM6 e TV-LACM14 foram tratados com meta-periodato, colchicina, tripsina, citochalasina e metronidazol e reavaliados quanto à capacidade de adesão e citoaderência. Foram determinados os níveis de expressão gênica de quatro adesinas (AP33, AP51, AP65 e AP120) em trofozoítos aderidos em placas de poliestireno e às CEVs. Os isolados ATCC 30236, TV-LACM6 e TV-LACM14 foram usados na determinação da adesão ao DIU e ao anel vaginal e a adesão a esses dispositivos foi confirmada por microscopia confocal. Resultados: A revisão sistemática da literatura demonstrou que são raros os estudos quanto à prevalência e incidência da tricomonose no mundo. Reafirma-se, portanto, a posição da tricomonose como uma doença parasitária negligenciada. Dentre os nove candidatos a genes de referência (actina, F-actina (β e α), tubulina (α, β e γ), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, fator de elongamento e DNA topoisomerase II), os genes α-tubulina, actina e DNATopII foram os mais estáveis, nas condições de limitação de nutrientes. Dos 32 isolados avaliados, 59 (35%) aderiram ao plástico. Após os tratamentos químicos observou-se que os isolados TV-LACM6 e TV-LACM14 reduziram os níveis de adesão tanto às CEVs quanto ao plástico, demonstrando que o T. vaginalis realiza a patogênese através de adesão e citoaderência por múltiplos mecanismos, os quais envolvem a participação do lipofosfoglicano e proteínas de membrana. Na análise da expressão gênica constatou-se que nos trofozoítos aderidos às CEVs houve aumento na expressão das quatro adesinas (AP33, AP51, AP65 e AP120). Por outro lado, nos trofozoítos aderidos ao plástico não existiu aumento nos níveis de expressão desses genes. Os isolados TV-LACM6 e TV-LACM14 aderiram ao DIU e ao anel vaginal, já o isolado ATCC 30236 apresentou praticamente nula adesão a tais dispositivos. Conclusões: Considerando a revisão sistemática da literatura constatou-se que existem poucos estudos, com qualidade metodológica, quanto à prevalência e incidência da tricomonose, assim pouco se sabe sobre a realidade epidemiológica dessa doença. A validação de genes de referência originou o primeiro relato deste tipo de estudo em T. vaginalis, no qual demonstramos que os genes mais estáveis foram αtubulina, actina e DNATopII; por outro lado, os mais instáveis foram GAPDH e βtubulina. Em relação ao estudo da adesão de T. vaginalis a superfícies abióticas concluímos que os trofozoítos de T. vaginalis aderem no DIU e ao anel vaginal e é inédita a descrição desse fenômeno. Ao analisarmos os mecanismos envolvidos na adesão e citoaderência concluímos que o LPG tem um papel importante em ambos os processos, por outro lado, as adesinas de superfície parecem não estar envolvidas na adesão a superfícies abióticas (plástico). Finalmente, nossos resultados reafirmam a importância do T. vaginalis como um importante problema para mulheres em idade reprodutiva, pois, a adesão aos dispositivos contraceptivos poderá facilitar a infecção. Além disso, nossos resultados indicaram uma possível diferença entre o processo de citoaderência e adesão ao plástico, uma vez que uma maior expressão das adesinas foi observado somente entre os trofozoítos aderidos às células epiteliais vaginais. No entanto, o LPG parece ser importante tanto na citoaderência quanto na adesão ao plástico, uma vez que a oxidação do LPG reduziu de forma similar e de forma significativa a citoaderência e a adesão. Esses resultados indicam que o T. vaginalis possui um complexo mecanismo de citoaderência e adesão que garantirá o sucesso do parasitismo.

Introduction: Trichomonas vaginalis is an extracellular protozoan and the etiologic agent of trichomonosis, the most prevalent sexually transmitted disease in the world. Cytoadherence has been the most studied pathogenic mechanism, however, there are few studies about adherence to plastic by T. vaginalis and to the best of our knowledge no study has evaluated the T. vaginalis adhesion to intrauterine device (IUD) and vaginal ring. Objectives: (i) to conduct a systematic review in order to determine both prevalence and incidence values of trichomonosis among general population from fivecontinent regions; (ii) to determine the stability from candidate reference genes for use in gene expression normalization; (iii) to evaluated the ability of T. vaginalis fresh isolates to adhere to plastic, host cells and contraceptive devices; (iv) to compare the mechanism involved in adhesion to plastic and cytoadherence processes. Methods: We conducted a systematic review of the literature following PRISMA guidelines. The transcripts of nine candidate reference genes were quantified using qRT-PCR under different cultivation conditions, and the stability of these genes was compared using the geNorm and NormFinder algorithms. Herein we investigated the adherence ability of T. vaginalis fresh clinical isolates to plastic, IUD and vaginal ring. The influence of LPG, cytoskeletal components of the parasite, surface molecules and the gene expression from four adhesins proteins were also investigated in the cytoadherence to human cells and in adhesion to plastic. . Results: The systematic review showed that the most robust data were found in the US; in the other hand other regions have limited numbers of studies, thus the data obtained in this review point that the overall burden of trichomonosis in world as a whole is still unknown. In the validation of reference genes, the most stable genes were α-tubulin, actin and DNATopII, and, conversely, the widely used T. vaginalis reference genes GAPDH and β-tubulin were less stable. Of 32 T. vaginalis isolates studied here, 19 (59.37%), were able to adhere in polystyrene microplates. The T. vaginalis isolates TV-LACM6 and TV-LACM14, which were strong plastic-adherent, were also able to adhere to IUD and vaginal ring. Following chemical treatments, the T. vaginalis components, LPG, cytoskeletal proteins and other surface molecules, were involved in both adherence to plastic and cytoadherence. The gene expression level from four adhesins proteins were highest in trophozoites adhered in CEVs than in trophozoites adhered to the abiotic surface (plastic). Conclusions: Few data about the numbers of prevalence and incidence of trichomonosis are available, consequently robust epidemiological studies of prevalence and incidences showing the disease ongoing are needed to guide priorities and define public health policies. Considering the validation of reference genes, this study is the first systematic exploration of T. vaginalis to identify optimal reference genes for qRT-PCR normalization under different culture conditions. This is valuable for future research on T. vaginalis gene expression studies. Finally, our results reaffirm the importance of T. vaginalis as an important problem among women in reproductive age, because the trophozoites were able to adhere in contraceptive devices and this fact could facilitate the parasite infection in the vaginal cavity. Moreover, our results indicate a possible difference between cytoadherence process and adhesion to plastic, subsequently the high level of adhesin protein expression were observed only in trophozoites attached to VECs. However, the LPG appears to be important in both processes, since the oxidation of LPG similarly and significantly reduced the adherence and cytoadherence. These results indicate that T. vaginalis presents multiple and complex mechanisms for attachment to host cells and to abiotic surfaces, ensuring successful parasitism.