Microscopia confocal in vivo: estabelecimento da técnica de time lapse para a análise da captação de vesículas extracelulares liberadas por células tronco mesenquimais em cultura de células

Abstract

Introdução: durante décadas, a única solução para estudar o comportamento de certos componentes celulares, foi pelo isolamento por fracionamento e purificação. Ou ainda através da fixação da célula num momento fisiológico completo, para poder aplicar diferentes técnicas de estudo. No entanto, dessa forma não é possível observar de forma direta, como os componentes celulares interagem entre si, ou a interação célula-a-células. Atualmente é possível o estudo da “célula viva”, e isso está para revolucionar e alterar os conceitos clássicos da biologia celular a uma grande velocidade. Objetivo: o objetivo deste estudo foi estabelecer as condições ideais para o estudo da captação e internalização de vesículas extracelulares por diferentes linhagens celulares utilizando técnicas de microscopia confocal em tempo real (time lapse). Método: utilizamos a técnica time lapse através da microscopia confocal para analisar as interações de células com vesículas extracelulares coletadas de células-tronco mesenquimais. Resultados: após fazermos imagens estáticas (in vitro) comprovamos que as vesículas extracelulares são internalizadas e, a partir de então, estabelecemos as técnicas e parâmetros para observar esse movimento. A partir de 2 h de incubação com as VEs verificou-se a presença das mesmas na região perinuclear. Através de microscopia time lapse (in vivo) observamos que a captação das VEs é muito rápida e ocorre nos primeiros minutos de incubação. Conclusão: neste estudo mostramos que para a visualização de células in vivo é importante determinar as condições ideais de incubação, estabelecendo o tempo de exposição e a intensidade do laser, assim como a frequência da captura das imagens para minimizar ao máximo o dano celular e o desaparecimento da fluorescência. Com base nesse estudo podemos estabelecer os parâmetros para analisar as células em tempo real.

Introduction: for decades, the only solution to study the behavior of certain cellular components was by fractionation isolation and purification. Or even by fixing the cell at a complete physiological moment, in order to be able to apply different techniques of study. However, in this way it is not possible to directly observe how the cellular components interact with each other, or the cell-to-cell interaction. It is now possible to study the "living cell", and this is to revolutionize and change the classical concepts of cell biology at a great speed. Objective: The purpose of this study was to establish the ideal conditions for the study of the uptake and internalization of extracellular vesicles by different cell lines using real time confocal microscopy techniques (time lapse). Method: We used the time lapse technique through confocal microscopy to analyze the interactions of cells with extracellular vesicles collected from mesenchymal stem cells. Results: After making static images (in vitro) we verified that the extracellular vesicles are internalized and, from then on, we established the techniques and parameters to observe this movement. After 2 h of incubation with the VEs the presence of the same ones in the perinuclear region was verified. Through time lapse microscopy (in vivo) we observed that the uptake of VEs is very fast and occurs within the first few minutes of incubation. Conclusion: In this study we showed that for the visualization of cells in vivo it is important to determine the ideal conditions of incubation, establishing the exposure time and laser intensity, as well as the frequency of image capture to minimize cell damage and disappearance of fluorescence. Based on this study we can establish the parameters to analyze the cells in real time.