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dc.contributor.advisorJobim, Maria Ines Mascarenhaspt_BR
dc.contributor.authorBustamante Filho, Ivan Cunhapt_BR
dc.date.accessioned2010-05-28T04:20:12Zpt_BR
dc.date.issued2010pt_BR
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/10183/23020pt_BR
dc.description.abstractO uso da tecnologia de DNA recombinante abre portas para um estudo detalhado da estrutura e função de proteínas, e a produção de proteínas recombinantes em sistema procarioto apresenta várias vantagens. A presente tese propõe a expressão heteróloga das proteínas aSFP, proteína ácida do fluido seminal bovino de 14 kDa, e osteopontina (OPN) de 55 kDa, relacionadas à congelabilidade do sêmen. Foram construídas bibliotecas de cDNA de vesícula seminal, próstata e glândula bulbouretral. Oligonucleotideos iniciadores foram sintetizados baseados nas seqüências disponíveis no GenBank (aSFP: número de acesso NM_174616, OPN: número de acesso M66236). Os amplicons resultantes das reações de PCR foram clonados em pET23a(+). Os plasmidios pET-aSFP e pET-OPN foram transformados em linhagens eletrocompetentes de E. coli BL21, BL21 (DE3), BL21 Star, BL21 Codon Plus e BL21 pLysS. Para expressão das proteínas recombinantes foram testadas diferentes concentrações de indutor de expressão IPTG, e diferentes tempos e temperaturas de indução. A expressão recombinante foi avaliada por SDS-PAGE, usando como controle cultivo não induzido. Das cinco linhagens transformadas com pET-aSFP, somente E. coli BL21 pLysS induzida com 0,5 mM de IPTG por 3 horas a 37°C apresentou uma banda de aproximadamente 15 kDa, compatível com o tamanho esperado de aSFPr-6xHis. Por cromatografia de afinidade com metal imobilizado em condições desnaturantes foi possível um rendimento de purificação de 2,5mg/mL de aSFPr-6xHis por 10 mL de cultura bacteriana. Contudo, a expressão de OPNr-6xHis, também obtida com a linhagem de E. coli BL21 pLysS, foi de baixa eficiência, o que não permitiu sua purificação. A produção recombinante de proteínas do plasma seminal é uma das mais novas ferramentas para o estudo de suas funções. O aperfeiçoamento dos processos de expressão e purificação é fundamental no desenvolvimento desta biotecnologia, que possui grande potencial terapêutico e diagnóstico.pt
dc.description.abstractThe use of recombinant DNA technology makes possible a deeper investigation on protein structure and function. Also the production of recombinant proteins has several advantages. The present thesis presents the recombinant expression of the 14 kDa acidic seminal fluid protein (aSFP) and osteopontin (55 kDa), both associated with bovine semen freezability. cDNA libraries from prostate, seminal vesicle and bulbouretral gland were constructed, and primers were designed based on data available on Genebank (aSFP: access number NM_174616; OPN: access number M66236). Amplicons of the target genes were cloned into pET23a(+), and the constructs pET-aSFP and pET-OPN were transformed into electrocompetent E. coli strains: BL21, BL21 (DE3), BL21 Star, BL21 Codon Plus e BL21 pLysS. For the expression trials, different concentrations of IPTG were tested, as well several different expression induction conditions. The recombinant expression was analyzed by SDS-PAGE and western blotting. The best expression for aSFPr-6xHis (15 kDa) was obtained with the strain BL21 pLysS, induced with 0.5 mM IPTG in 3 hours at 37°C. The target protein was purified by immobilized metal ion chromatography in denaturing conditions with a yield of 2.5 mg/mL per 10 mL of bacterial culture. The recombinant expression of OPNr-6xHis was also possible with the pLysS strain, however in a lower efficiency. The low amount of recombinant OPN did not allow its purification. The production of seminal plasma recombinant proteins is a new tool for the study of its functions. The improvement of expression and purification processes is important for this biotechnology which has a great potential for therapeutic and diagnose applications.en
dc.format.mimetypeapplication/pdfpt_BR
dc.language.isoporpt_BR
dc.rightsOpen Accessen
dc.subjectBovinopt_BR
dc.subjectProdução animalpt_BR
dc.subjectInseminacao artificialpt_BR
dc.subjectReprodução animalpt_BR
dc.subjectGenética animalpt_BR
dc.titleClonagem, expressão e purificação de proteínas do plasma seminal bovino relacionadas à alta congelabilidade do sêmenpt_BR
dc.title.alternativeCloning, expression and purification of the proteins from bovine seminal plasma osteopontin and acidic seminal fluid protein related with semen freezability en
dc.typeTesept_BR
dc.contributor.advisor-coLima, Elizabeth Obino Cirnept_BR
dc.identifier.nrb000741489pt_BR
dc.degree.grantorUniversidade Federal do Rio Grande do Sulpt_BR
dc.degree.departmentFaculdade de Agronomiapt_BR
dc.degree.programPrograma de Pós-Graduação em Zootecniapt_BR
dc.degree.localPorto Alegre, BR-RSpt_BR
dc.degree.date2010pt_BR
dc.degree.leveldoutoradopt_BR


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