O sulfeto de hidrogênio e o ácido etilmalônico, metabólitos acumulados na encefalopatia etilmalônica, induzem disfunção bioenergética e abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial em cerebelo de ratos

Abstract

A encefalopatia etilmalônica (EE) é uma doença genética grave de sintomatologia predominantemente neurológica, e bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo tecidual de sulfeto de hidrogênio (sulfeto) e ácido etilmalônico (EMA). Visto que a fisiopatologia do dano cerebelar observado em pacientes acometidos pela EE não está estabelecida, avaliamos os efeitos do sulfeto e do EMA sobre parâmetros de bioenergética mitocondrial, poro de transição de permeabilidade mitocondrial (PTPM) e homeostase redox em cerebelo de ratos. Observamos que o sulfeto e o EMA diminuíram a respiração mitocondrial, prejudicando a transferência de elétrons e a fosforilação oxidativa. Além disso, ambos metabólitos induziram inchamento mitocondrial e diminuíram o potencial de membrana e a capacidade de retenção de cálcio em mitocôndrias de cerebelo, efeitos que foram prevenidos pela combinação de ciclosporina A e ADP, e pelo vermelho de rutênio, sugerindo indução da abertura do PTPM. No caso dos efeitos apenas do sulfeto, a adição de melatonina, um antioxidante, e N-etilmaleimida, um agente alquilante de grupamentos tiois, também preveniu as alterações mitocondriais induzidas por esse metabólito. O sulfeto ainda diminuiu o potencial de membrana mitocondrial e causou morte celular em culturas de neurônios cerebelares, efeitos que também foram prevenidos por ciclosporina A e melatonina. Esses resultados sugerem que o sulfeto induz a abertura do PTPM via modificação de grupamentos tiois e geração de espécies reativas de oxigênio. No que se refere aos efeitos do EMA, foi observado que esse ácido inibiu de forma mista a atividade da α-cetoglutarato desidrogenase e aumentou o efluxo mitocondrial de α- cetoglutarato, os quais explicam o dano à respiração mitocondrial na presença de glutamato como substrato. Nos experimentos onde succinato foi usado como substrato, foi verificado que a diminuição da respiração mitocondrial pelo EMA foi prevenida pela adição de succinato exógeno, e atenuada pela permeabilização das mitocôndrias, indicando que o EMA altera o transporte mitocondrial de succinato. Simulações in silico também evidenciaram que o EMA afeta o transporte mitocondrial tanto de succinato quanto de glutamato. Finalmente, foi verificado que altas concentrações de EMA aumentaram os níveis de superóxido e alteraram as defesas antioxidantes de forma moderada. Nossos resultados indicam que prejuízos na bioenergética mitocondrial e abertura do PTPM induzidos pelo sulfeto e EMA são mecanismos potencialmente envolvidos na fisiopatologia das anormalidades cerebelares vistas na EE. Além disso, uma vez que elevadas concentrações do EMA induziram estresse oxidativo, pode ser sugerido que esse mecanismo também contribui para a progressão da EE durante episódios de descompensação metabólica, que são caracterizados por aumento acentuado dos níveis dos metabólitos acumulados.

Ethylmalonic encephalopathy (EE) is a genetic disease with severe neurological symptoms and biochemically characterized by tissue accumulation of hydrogen sulfide and ethylmalonic acid (EMA). Since the pathophysiology of cerebellar abnormalities observed in EE has not been studied, we evaluated the effects of hydrogen sulfide and EMA on mitochondrial bioenergetics, mitochondrial permeability transition pore and redox homeostasis in cerebellum of young rats. Sulfide and EMA decreased mitochondrial respiration supported by NADH- and FADH2-linked substrates. In addition, both metabolites induced mitochondrial swelling and decreased mitochondrial membrane potential and calcium retention capacity in mitochondrial fractions, which were prevented by the combination of cyclosporine A and ADP, as well as by ruthenium red, suggesting induction of mitochondrial permeability transition pore opening. The addition of melatonin and N-ethylmaleimide also prevented these sulfide-induced mitochondrial changes. Sulfide further reduced the mitochondrial membrane potential and caused cell death in cerebellar neurons, which were also prevented by cyclosporine A and melatonin. These results suggest that sulfide induces mitochondrial permeability transition opening via modification of thiol groups and generation of reactive oxygen species. Regarding EMA effects, it was also observed that this acid inhibited the activity of α-KGDH in a mixed profile and increased the mitochondrial efflux of α-ketoglutarate, which explain the EMA-induced mitochondrial respiration decrease in the presence of glutamate as substrate. Furthermore, our data showed that the decreased respiration caused by EMA with succinate was prevented by the addition of exogenous succinate, and attenuated by the permeabilization of mitochondria, implying that the mitochondrial transport of succinate is affected by EMA. In silico simulations also demonstrated that EMA disturbs the mitochondrial transport of both succinate and glutamate. Finally, it was found that EMA, at high concentrations, mildly increased the levels of superoxide and altered the antioxidant defenses in cerebellum. Our results indicate that mitochondrial bioenergetic disruption and PTPM opening induced by sulfide and EMA contribute to the pathophysiology of cerebellar abnormalities seen in EE. Additionally, since high levels of EMA induced oxidative stress, it is conceivable that this pathomechanism also contributes to EE pathogenesis during episodes of metabolic decompensation, which are characterized by marked elevation of accumulating metabolites.