Avaliação do sistema MALDI-TOF MS como ferramenta de triagem para a identificação e diferenciação do complexo Burkholderia cepacia

Abstract

As bactérias do Complexo Burkholderia cepacia (Bcc) estão comumente associadas à infecção no trato respiratório em pacientes com Fibrose Cística (CF). O tratamento das infecções por Bcc nesses pacientes é complexo e a infecção, em alguns casos, está relacionada a um mau prognóstico. De fato, a espécie Burkholderia cenocepacia, membro do Bcc, é frequentemente associada à pneumonia necrotizante. Portanto, a identificação precoce da B. cenocepacia pode favorecer o prognóstico dos pacientes com CF. No entanto, a identificação e diferenciação de membros do Bcc por métodos fenotípicos é difícil. Sendo assim, métodos moleculares são considerados o padrão ouro para a diferenciação dos membros, mas requerem um laboratório especializado e mão de obra qualificada. O uso da espectrometria de massa para a identificação de microrganismos como o sistema MALDI-TOF MS tem apresentado ótima acurácia para identificação das principais espécies bacterianas de importância clínica, embora a diferenciação de espécies de um mesmo complexo, como o Bcc, nem sempre seja possível. Tendo em vista a necessidade de agilidade diagnóstica, o objetivo deste estudo foi avaliar o desempenho do sistema MALDI-TOF MS como método de identificação da Burkholderia cenocepacia e a diferenciar de outras espécies do Bcc. Um total de 53 colônias sugestivas de Bcc foram analisadas pelo sistema MALDI-TOF usando dois protocolos de extração de proteínas: (A) Método direto: as colônias foram transferidas para uma placa de MALDI-TOF e fixadas com 1μL de ácido fórmico 70%; (B) Extração em tubo: as colônias foram transferidas para um microtubo e adicionadas 900 μL de etanol à 100%; após centrifugação o etanol foi removido e o pellet foi misturado com 25 μL de ácido fórmico 70% e 25 μL de acetonitrila 70%. Um volume de 1 μL da mistura foi transferido para a placa alvo do MALDI-TOF. Após a fixação das colônias na placa, em ambos os métodos, foi adicionado 1uL de ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico e após submetidas à identificação no equipamento Microflex MALDI-TOF (Bruker ®). Paralelamente, todos os isolados foram submetidos ao diagnóstico molecular (PCR com primers específicos) para identificação de espécies pertencentes ao Bcc e diferenciação de B. cenocepacia no genomovar IIIA ou IIIB. O MALDITOF foi capaz de identificar 100% (53/53) em nível de gênero e 94,34% (51/53) em nível de espécie, usando ambos os métodos de extração de proteína (A) e (B), de acordo com a PCR. Embora ambas as extrações tenham apresentado resultados confiáveis, o método (A) é mais rápido e requer menos reagentes. O sistema MALDI-TOF foi capaz de identificar corretamente 38 dos 40 isolados identificados como B. cenocepacia pela técnica de PCR. O sistema MALDI-TOF (Bruker®), devido a sua praticidade e custo baixo, pode ser usado como metodologia para diferenciar as espécies de Bcc.

Bacteria of the Burkholderia cepacia Complex (Bcc) are commonly associated with respiratory tract infection in patients with cystic fibrosis (CF). In fact, Burkholderia cenocepacia, a member of the Bcc, is commonly associated with necrotizing pneumonia in some CF patients. Therefore, an early identification of B. cenocepacia would favor the prognosis among CF patients. However, the identification of Bcc species is difficult to be achieved using phenotypic methods. Molecular methods are considered the gold standard for those differentiation, but those assays require a skilled labor, time to prepare and high costs. The use of mass spectrometry, such as MALDI-TOF MS system, for identification of microorganisms has been presented a very good accuracy. Although, the differentiation of species within the same complex, such as Bcc, may not always be achieved by MALDI-TOF. Due to the need for rapid diagnosis of Bcc species, the objective of this study was to evaluate the performance of MALDI-TOF MS system for identification of Burkholderia cenocepacia and differentiates from other Bcc species. A total of 53 colonies suggestive of Bcc were submitted to MALDI-TOF (Bruker®) system for identification and two protocols of protein extraction were compared (A) Direct Method and (B) Tube Extraction. In parallel, all isolates were subjected to molecular diagnosis (PCR with primers for recA gene) to identify species belonging to Bcc and to differentiate B. cenocepacia in genomovar IIIA or IIIB. MALDI-TOF was able to discriminate 100% (53/53) of the isolates to the gender level and 94.34% (50/53) to the species using either method, according to the PCR. Although both extractions presented reliable results, method (A) is faster and requires fewer reagents. Moreover, the MALDI-TOF system was able to identify 38 out of the 40 isolates identified by the molecular technique as B. cenocepacia. Due to the fact that MALDI-TOF (Bruker®) is a feasible technique and presents a low cost of reagents, it can be used for reliable identification of species of the Bcc complex.