Avaliação da participação da ecto-5’-nucleotidase/CD73 na progressão de gliomas e mecanismos de resistência à quimioterapia padrão

Abstract

Os gliomas são o tipo tumoral que mais acomete o SNC. O glioblastoma (GBM) é um glioma de grau IV, originado de astrócitos ou de células precursoras de astrócitos. O GBM é um tumor bastante agressivo, que apresenta uma elevada taxa de proliferação e um comportamento altamente invasivo. Muitos estudos têm demonstrado que o GBM apresenta um aumento da atividade e expressão da ecto-5’-nucleotidase/CD73 (e5NT/CD73), comportamento oposto às células análogas normais, os astrócitos, e que essa enzima auxilia na progressão desses tumores. Além da função enzimática, foi mostrado que a e5NT/CD73 também exerce importante papel na interação célula-célula e célula-matriz. As células C6 de glioma de rato são descritas como um ótimo modelo in vitro para estudo de gliomas e em altas passagens são utilizadas como modelo de astrócito. Estudos do nosso laboratório demonstraram que cérebro de ratos inoculados com células C6 de alta passagem, desenvolvem tumores menores, em relação aos animais em que foram implantadas células C6 de baixa passagem. Com isso, no presente estudo caracterizamos o papel desempenhado pela e5NT/CD73 no crescimento de GBM in vitro e in vivo. Foi observado uma significativa redução da hidrólise do AMP pelas células C6 de baixa passagem. Esse resultado foi confirmado por citometria de fluxo, onde demonstrou-se que essa célula expressa menos e5NT/CD73 e que o perfil de expressão das NTPDases é bastante semelhante nas duas linhagens. Em relação a capacidade proliferativa das células, verificamos por marcação para Ki67, que as linhagens não diferem em relação à proliferação. Entretanto quando tratadas com AMP (substrato da e5NT/CD73), apenas as células C6 de baixa passagem modificam o perfil de crescimento. Assim, demonstrando a importância da presença de e5NT/CD73 e consequente formação de adenosina para a progressão dos gliomas. Verificamos também alguns parâmetros de malignidade que envolvem a e5NT/CD73, já que é também uma proteína que auxilia na adesão e migração. Observamos que as células C6 de baixa passagem possuem uma capacidade adesiva menor e consequentemente, uma capacidade maior de migração comparada a C6 de alta passagem. Além disso, verificamos que quando tratamos com APCP (inibidor da e5NT/CD73), as células C6 de baixa passagem tem seu potencial de migração reduzido, demonstrando que a migração é dependente, pelo menos em parte, da atividade da e5NT/CD73. Esses resultados foram confirmados pela análise de formação de colônia, onde verificamos que as células C6 de baixa passagem formam mais e maiores colônias que as células C6 de alta passagem, mesmo apresentando uma capacidade proliferativa muito semelhante, além disso, o APCP foi capaz de reduzir a formação de colônias. Adicionalmente, como já observado anteriormente, células C6 de alta passagem desenvolvem tumores menores quando implantadas no estriado de ratos. Em contrapartida as células C6 de baixa passagem desenvolvem tumores característicos de GBM. Esses dados em conjunto demonstram que a presença da e5NT/CD73 é fundamental para a progressão do GBM e que a mesma representa um alvo interessante na corrida por tratamentos mais eficazes contra esse tumor. Finalmente, na segunda parte da presente Dissertação não foi possível chegar a uma conclusão clara entre o envolvimento da e5NT/CD73 e a resistência celular à temozolamida. Outros estudos são necessários para avaliarmos uma possível relação.

Gliomas are the tumor that most affects the CNS. Glioblastoma (GBM) is a grade IV glioma, originating from astrocytes or astrocyte precursor cells. GBM is a very aggressive tumor, with a high proliferation rate and highly invasive behavior. Many studies have shown that GBM shows an increase in the activity and expression of ecto-5'-nucleotidase/CD73 (e5NT/CD73), opposite to normal analog cells, astrocytes, and that this enzyme helps in the progression of these tumors. In addition to the enzymatic function, it has been shown that e5NT/CD73 also plays an important role in cell-cell and cell-matrix interaction. C6 rat glioma cells are described as an excellent in vitro model for studying gliomas and in late passages are used as an astrocyte model. Studies in our laboratory have shown that the brains of mice inoculated with late-pass C6 cells develop smaller tumors than animals in which early-pass C6 cells were implanted. Thus, in the present study we characterize the role played by e5NT/CD73 in the GBM grow in vitro and in vivo. A significant reduction in late-pass C6 AMP hydrolysis was observed, this result was confirmed by flow cytometry, where it was demonstrated that this cell expresses less e5NT/CD73 and that the expression profile of NTPDases are similar in both C6 line. Regarding the proliferative capacity of cells, we verified by Ki67, that the cells do not differ in relation to proliferation, however when treated with AMP (e5NT/CD73 substrate), only the early-pass C6 cells modify the growth profile, demonstrating the importance of the presence of e5NT/CD73 and the consequent formation of adenosine for the glioma progression. We also verified some malignancy parameters that involve e5NT/CD73, since it is also a protein that assists in adhesion and migration, and we observed that early-pass C6 cells have a lower adhesive capacity and, consequently, a higher migration capacity compared to late-pass C6. In addition, we found that the addition of APCP (e5NT/CD73 inhibitor) in early-pass C6 cells has reduced migration potential, demonstrating that migration is dependent, at least in part, on the activity of e5NT/CD73. These results were confirmed in vitro, by the analysis of colony formation, where we verified that the early-pass C6 cells form more and larger colonies than the late-pass C6 cells, even with a very similar proliferative capacity, in addition, the APCP was able to reduce the formation of colonies. Furthermore, as it was previously observed, late-pass C6 developed small tumor mass in the striatum of rats, which was confirmed by immunohistochemistry analyses. In contrast, all rats injected with early-pass C6 cells developed tumors with all histopathological features of GBMs. Taken together these results demonstrate that the presence of e5NT/CD73 is fundamental for the progression of GBM and that it represents an interesting target for more effective treatments against GBM. Finally, it was not possible to reach a clear conclusion between the involvement of e5NT/CD73 and cell resistance to temozolamide. Further studies are needed to assess a possible relationship.