Análise temporal das alterações cardiovasculares e pulmonares no modelo de hipertensão arterial pulmonar induzida por monocrotalina

Abstract

A hipertensão arterial pulmonar (HAP) é uma doença progressiva e fatal, que promove um remodelamento vascular pulmonar obstrutivo, culminando no aumento da resistência vascular pulmonar (PVR) e da pressão arterial pulmonar média (mPAP). Como consequência, há sobrecarga de pressão para o VD que hipertrofia (HVD) e, em estágios avançados, desenvolve insuficiência cardíaca direita (ICD). A monocrotalina (MCT) corresponde ao principal modelo experimental de estudo da patologia e de novos alvos terapêuticos para a HAP. No entanto, poucos estudos focaram na análise da progressão da HAP induzida por MCT e seus efeitos em diferentes tecidos. Por isso, o objetivo desta tese foi avaliar a progressão da HAP induzida por MCT através da análise de parâmetros morfométricos, ecocardiográficos, hemodinâmicos, bioquímicos, moleculares e histológicos, a fim de caracterizar a evolução da doença em diferentes tecidos. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFRGS (número 32151). Ratos machos foram divididos em dois grupos: MCT e controle. O grupo MCT recebeu uma única injeção (60 mg / kg, i.p.) de MCT, enquanto o controle recebeu solução salina na mesma dose. Na sequência, os grupos MCT e controle foram divididos em 3 grupos: 1, 2, e 3 semanas (primeiro protocolo experimental) ou em 4 grupos: 1, 2, 3 e 4 semanas (segundo protocolo experimental). Para o primeiro protocolo experimental, as seguintes análises foram realizadas: ecocardiográfica (índice de performance miocárdica (MPI) e relação entre tempo de aceleração e tempo de ejeção pela artéria pulmonar (AT/ET), hemodinâmica (pressão arterial pulmonar média-mPAP) e morfométrica (hipertrofia do ventrículo direito-HVD). O pulmão foi usado para análises histológicas (determinação da espessura da parede pulmonar, extensão do dano tecidual, quantificação celular e deposição de colágeno), bioquímicas (atividade da NADPH oxidase –Nox, catalase –CAT, superóxido dismutase –SOD, glutationa peroxidase –GPx, tiorredoxina redutase – TrxR, glutationa redutase –GR e óxido nítrico sintase –NOS, concentração de sulfidrila, espécies reativas de oxigênio total –ROS e TBARS), moleculares (expressão da eNOS, relação entre os receptores da endotelina-1 [ETAR e ETBR], expressão de Trx-1 e seu regulador VDUP-1- vitamina D (3) proteína regulada positivamente 1; fator nuclear 2 relacionado ao fator eritroide; proliferação celular [razão entre Akt total e fosforilada], vias de morte celular [caspase-3, razão entre JNK total e fosforilada e razão entre p38 total e fosforilada] e inflamação [razão entre NF-κβ 65 total e fosforilado, HSP70]) e imunohistoquímica (marcação com nitrotirosina). O segundo protocolo experimental consistiu na submissão dos animais ao exame ecocardiográfico (excursão sistólica do plano anular tricúspide (TAPSE), velocidade máxima de enchimento rápido e lento do ventrículo direito (relação E / A), mudança da área fracional do ventrículo esquerdo (FAC) e fração de ejeção ventricular (FE) e análise hemodinâmica (pressões sistólica e diastólica de VD e VE e suas derivadas de contratilidade e relaxamento), seguida de eutanásia. A modulação autonômica foi avaliada pela análise espectral considerando dois componentes espectrais: baixa frequência (LF) e alta frequência (HF). VD e VE foram usados, ainda, para análises morfométricas (HVD), bioquímicas (concentração de peróxido de hidrogênio (H2O2) e TBARS, atividade da SOD, CAT, GPx e conteúdo de sulfidrila) e histológicas (determinar o infiltrado inflamatório). Os dados foram submetidos ao teste de normalidade Shapiro-Wilk. Os resultados com distribuição normal foram analisados pela ANOVA de duas vias, complementada pelo teste de Student-Newman-Keuls, enquanto os resultados sem distribuição normal foram analisados pelo teste de comparação múltipla de Kruskal-Wallis (P <0,05). No pulmão, a HAP promoveu aumento nas atividades da Nox e SOD, aumento de ROS, expressão de eNOS e dano nitrosativo na primeira semana. Além disso, houve aumento da atividade de TrxR, da expressão de Trx-1 e VDUP-1, e redução da atividade da GR. Após duas semanas da administração de MCT, mostrou-se aumento da NOS e redução da atividade da CAT. Foi observada, também, redução da expressão da Trx-1, Nrf2 e HSP70, bem como aumento da expressão de VDUP-1 e das vias de proliferação, inflamação e apoptose. Na terceira semana, a HAP aumentou a atividade de SOD e NOS, diminuiu a expressão de eNOS e o conteúdo de sulfidrilas, aumentou a razão ETAR/ETBR, a concentração de ROS e do dano oxidativo (TBARS) e nitrosativo (nitrotirosina). Somado a isso, foi observado aumento da atividade de TrxR, redução da expressão de Trx-1, Nrf2 e HSP70, aumento da expressão de VDUP-1, ativação de proliferação celular e inflamação. Nenhuma diferença significativa foi encontrada nas vias apoptóticas. Todas essas alterações foram acompanhadas por remodelamento dos vasos pulmonares e extensa lesão no parênquima pulmonar. Além disso, deposição de colágeno foi encontrada em estágios avançados. Como consequência desse remodelamento pulmonar, houve aumento da mPAP e desenvolvimento de HVD após 2 e 3 semanas em comparação aos seus grupos controles.O desenvolvimento de HAP induziu redução da razão AT/ET e aumento do MPI na terceira semana. No tecido cardíaco, a indução com MCT promoveu aumento na pressão sistólica do VD, na concentração de H2O2, atividade de CAT e TBARS, e diminuição do conteúdo de sulfidrilas no VD, associado à inflamação leve, enquanto no VE foi encontrado apenas aumento no conteúdo de sulfidrilas. Após duas semanas, houve, aumento da pressão sistólica do VD, conteúdo de sulfidrilas no VD, inflamação leve a moderada, HVD, enquanto no VE foi constatada inflamação leve e diminuição do conteúdo de sulfidrilas. Após três semanas, a HAP, no VD, levou à inflamação moderada a acentuada, diminuição da atividade da SOD e aumento da atividade da GPx e do dano oxidativo a lipídios. No VE, foi encontrado aumento de dano oxidativo e inflamação leve. Esta fase também foi caracterizada pelo aumento do tônus simpático e diminuição do tônus parassimpático. Dessa forma, no tecido pulmonar, a primeira semana foi marcada pela presença de estresse nitrosativo, que levou a uma adaptação após 2 semanas. O estresse oxidativo pulmonar foi evidente na terceira semana, provavelmente por um desequilíbrio entre os receptores da endotelina-1, resultando em remodelamento da matriz extracelular, disfunção endotelial e HVD. Assim, acredita-se que essas alterações no VD sejam decorrentes de alterações pulmonares anteriores. Aqui demonstramos essas alterações pulmonares através de um desequilíbrio na expressão das defesas antioxidantes, destacando uma redução na expressão de Trx-1 e um aumento no seu inibidor intrínseco, VDUP-1. Também demonstramos um envolvimento temporal das vias de sinalização relacionadas à proliferação e inflamação. No tecido cardíaco, é plausível supor que as mudanças observadas no estresse oxidativo e na inflamação estejam intimamente relacionadas às alterações iniciais induzidas pela HAP no VD, enquanto o desequilíbrio autonômico parece contribuir para a exacerbação dessa conversa cruzada nas fases avançadas da doença. Em contrapartida, devido à falta de efeito direto, o VE sofreu poucas alterações em resposta à administração da MCT.

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a progressive and fatal disease that promotes an obstructive pulmonary vascular remodeling, culminating in an increase in pulmonary vascular resistance (PVR) and mean pulmonary arterial pressure (mPAP). As a consequence, there is pressure afterload for the right ventricle (RV), which hypertrophies (RVH) and, in advanced stages, develops right heart failure (RVF). Monocrotaline (MCT) corresponds to the main experimental model for studying pathology and new therapeutic targets for PAH. Few studies have focused on analyzing the progression of PAH induced by MCT and its effects on different tissues. Therefore, the objective of this thesis was to evaluate the progression of PAH induced by MCT through the analysis of morphometric, echocardiographic, hemodynamic, biochemical, molecular and histological parameters, in order to characterize the evolution of the disease in different tissues (lung, RV and left ventricle (LV), pulmonary artery). This study was approved by the UFRGS Research Ethics Committee (number 32151). Male rats were divided into two groups: MCT and control. The MCT group received a single injection (60 mg / kg, i.p.) of MCT, while the control received saline in the same dose. Then, the MCT and control groups were divided into 3 groups: 1, 2, and 3 weeks (first experimental protocol) or 4 groups: 1, 2, 3, and 4 weeks (according to the experimental protocol).For the first experimental protocol, the following analyzes were performed: echocardiography (myocardial performance index - MPI and relationship between acceleration time and ejection time through the pulmonary artery (AT/ET), hemodynamics (mPAP), and morphometry (RVH). Lung was used for histological analysis (determination of the thickness of the pulmonary wall, extent of tissue damage, cell quantification and collagen deposition), biochemical analysis (NADPH oxidase –Nox, catalase –CAT, superoxide dismutase –SOD, glutathione peroxidase –GPx activity, thioredoxin reductase - TrxR, glutathione reductase –GR and nitric oxide synthase –NOS, sulfhydryl concentration, reactive total oxygen species –ROS and TBARS), molecular (expression of eNOS, relationship between endothelin-1 receptors [ETAR and ETBR] , expression of Trx-1 and its regulator VDUP-1- vitamin D (3) positively regulated protein 1; nuclear factor 2 related to erythroid factor; cell proliferation [ratio between total and phosphorylated Akt] , cell death pathways [caspase-3, ratio between total and phosphorylated JNK and ratio between total and phosphorylated p38] and inflammation [ratio between total and phosphorylated NF-κβ 65, HSP70]) and immunohistochemistry (nitrotyrosine labeling). The second experimental protocol consisted of submitting the animals to echocardiographic examination (systolic excursion of the tricuspid annular plane (TAPSE), maximum speed of fast and slow filling of the RV (E/A ratio), alteration of the fractional area of the left ventricle (FAC) and ventricular ejection fraction (EF)) and hemodynamic analysis (systolic and diastolic pressures of RV and LV and their derivatives of contractility and relaxation), followed by euthanasia. Autonomic modulation was evaluated by spectral analysis considering two spectral components: low frequency (LF) and high frequency (HF). RV and LV were also used for morphometric (RVH), biochemical (hydrogen peroxide (H2O2) and TBARS, activity of SOD, CAT, GPx and sulfhydryl content) and histological analyzes (to determine the inflammatory infiltrate). The data were submitted to the Shapiro-Wilk normality test. The results with normal distribution were analyzed by two-way ANOVA, complemented by the Student-Newman-Keuls test, while the results without normal distribution were analyzed by the Kruskal-Wallis multiple comparison test (P<0.05). In the lung, PAH increased the activities of Nox and SOD, increased ROS, eNOS expression and nitrosative damage in the first week. In addition, there was an increase in TrxR activity, Trx-1 and VDUP-1 expression, and a decrease in GR activity. After two weeks of MCT administration, there was an increase in NOS and a reduction in CAT activity. It was also observed a reduction in the expression of Trx-1, Nrf2 and HSP70, as well as an increase in the expression of VDUP-1 and the proliferation, inflammation and apoptosis pathways. In the third week, HAP increased SOD and NOS activity, decreased eNOS expression and sulfhydryl content, increased the ETAR / ETBR ratio, the concentration of ROS and oxidative damage (TBARS) and nitrosative (nitrotyrosine). In addition, increased activity of TrxR, reduced expression of Trx-1, Nrf2 and HSP70, increased expression of VDUP-1, activation of cell proliferation and inflammation were observed. No significant differences were found in the apoptotic pathways. All of these changes were accompanied by remodeling of the pulmonary vessels and extensive injury to the lung parenchyma. In addition, collagen deposition has been found in advanced stages. As a consequence of this pulmonary remodeling, there was an increase in mPAP and development of RVH after 2 and 3 weeks compared to its control groups. The development of PAH induced a reduction in the AT/ET ratio and an increase in MPI in the third week. In cardiac tissue, induction with MCT promoted an increase in RV systolic pressure, H2O2 concentration, CAT and TBARS activity, and a decrease in the sulfhydryl content in the RV, associated with mild inflammation, whereas in the LV, only an increase in the content was found sulfhydryl. After two weeks, there was an increase in RV systolic pressure, content of sulfhydryl in RV, mild to moderate inflammation, RVH, while in LV there was mild inflammation and decreased content of sulfhydryl. After three weeks, PAH, in the RV, led to moderate to severe inflammation, decreased SOD activity and increased GPx activity and oxidative damage to lipids. In the LV, increased oxidative damage and mild inflammation were found. This phase was also characterized by an increase in sympathetic tone and a decrease in parasympathetic tone. Thus, in the lung tissue, the first week was marked by the presence of nitrosative stress, which led to an adaptation after 2 weeks. Oxidative pulmonary stress was evident in the third week, probably due to an imbalance between endothelin-1 receptors, resulting in remodeling of the extracellular matrix, endothelial dysfunction and RVH. Thus, it is believed that these changes in the RV are due to previous pulmonary changes. Here we demonstrate these pulmonary changes through an imbalance in the expression of antioxidant defenses, highlighting a reduction in the expression of Trx-1 and an increase in its intrinsic inhibitor, VDUP-1. We also demonstrated a temporal involvement of the signaling pathways related to proliferation and inflammation. In cardiac tissue, it is plausible to assume that the changes observed in oxidative stress and inflammation are closely related to the initial changes induced by PAH in the RV, while the autonomic imbalance seems to contribute to the exacerbation of this cross-talk in the advanced stages of the disease. On the other hand, due to the lack of direct effect, the LV underwent few changes in response to the administration of MCT.