Efeito, in vitro, dos hormônios stanniocalcinas sobre a gliconeogênese hepática e renal de ratos alimentados e em Jejum

Abstract

A stanniocalcina (STC) é um hormônio glicoproteico descoberto em peixes e posteriormente detectado em mamíferos. As isoformas STC-1 e STC 2 são expressas em distintos órgãos de mamíferos como fígado e rins, sugerindo importante contribuição fisiológica destes hormônios. No jejum, com níveis de glicogênio diminuídos, a gliconeogênese hepática e renal contribuem para a manutenção dos níveis plasmáticos de glicose. O objetivo deste trabalho foi estudar o papel dos hormônios STC-1 e STC-2 humanos (hSTCs) sobre o metabolismo da glicose e do lactato no tecido hepático e renal de ratos alimentados e em jejum; determinar a capacidade da hSTC-1 de modular o sinal de adenosina 3',5'-monofosfato cíclico (cAMP) sobre a atividade gliconeogênica renal. Métodos: Ratos Wistar machos adultos (n = 120) divididos em dois grupos: 1) alimentados, que receberam água e dieta padrão para roedores ad libitum; 2) em jejum de 24h para o estudo no fígado ou 48h para o estudo no rim. Os animais foram eutanasiados por decapitação, o sangue troncular coletado, fígado e rins excisados e fatiados para os experimentos in vitro. As fatias de fígado, de córtex e de medula renal do grupo controle foram incubados com Krebs Ringer Bicarbonato (KRB) pH 7,4 ou Krebs Ringer Henseleit (KRH) pH 7,4, respectivamente, sem hSTCs. As fatias de fígado foram incubadas na presença de hSTC-1 e de hSTC-2 nas concentrações de 3,86pM e 38,6pM.Foram avaliadas no tecido hepático a atividade gliconeogênica, a partir de 14C-alanina e de 14C-lactato, a oxidação da 14C-glicose, a concentração de glicogênio, a síntese de glicogênio a partir de 14C-glicose, as expressões dos genes Pck1, Stc1 e Stc2. No córtex e na medula renal foram avaliados os efeitos da hSTC-1, nas concentrações de 0,386pM; 3,86pM; 386pM e 3860pM, sobre atividade gliconeogênica e oxidação do 14C-lactato, assim como a expressão do gene Pck1. Foi determinado o papel da hSTC-1 sobre a modulação do sinal estimulador do cAMP sobre a gliconeogênese renal de ratos alimentados. Os dados foram expressos como a média ± erro padrão da média e a análise estatística foi realizada de acordo com os testes de normalidade de Kolmogorov-Smirnoff. ANOVA de uma ou duas vias foi utilizada para determinar as diferenças significativas. Dados sorológicos e de expressão gênica foram analisados com teste t de Student. As diferenças foram significativas quando P<0,05. O presente estudo foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da UFRGS sob o número de 29392. Resultados: Fígado- No estado alimentado foi detectada a presença de Stc1; após jejum de 24h, as expressões dos genes da Stc1 e da Stc2 aumentaram (P<0,05) no fígado. No estado alimentado, a síntese de 14C-glicose a partir de 14C-alanina diminuiu com 38,6pM de hSTC-2 e foi acompanhada de redução na expressão da Pck1 com 3,86 e 38,6pM de hSTC-2. Após o jejum de 24h, 38,6pM de hSTC-1 estimulou a gliconeogênese a partir de 14C-lactato. Igualmente, 3,86 e 38,6pM de hSTC-2 elevaram a atividade gliconeogênica a partir de 14C-lactato no fígado de ratos jejuados. O aumento na expressão de Pck1 ocorreu apenas na presença de 3,86pM. As hSTCs, nas concentrações utilizadas não alteraram a capacidade de oxidação da 14C-glicose, a concentração de glicogênio e sua síntese a partir de 14C glicose no fígado de ratos alimentos ou jejuados (24h). Rim- No córtex renal de ratos alimentados somente 3860pM de hSTC-1 aumentou (P<0,05) a capacidade gliconeogênica a partir de 14C-lactato e a expressão (P<0,05) do Pck1. Além disso, 0,386pM de hSTC-1 estimulou (P<0,05) a oxidação de 14C lactato. No córtex renal de ratos em jejum (48h) a hSTC-1 nas concentrações utilizadas não modificaram a atividade gliconeogênica nem a oxidação de 14C lactato. A hSTC-1 não alterou a atividade gliconeogênica ou a oxidação a partir de 14C-lactato na medula renal de ratos alimentados. No jejum (48h), 3,86pM de hSTC-1 aumentou (P<0,05) a atividade gliconeogênica na medula renal a partir de 14C-lactato, mas não aumentou (P>0,05) a expressão da Pck1 nem a oxidação de 14C-lactato. A atividade gliconeogênica no córtex renal de ratos alimentados aumentou 50% (P<0,05) com 25µM de forskolin (FK) mais 2mM de 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), mas 3,86pM de hSTC-1 inibiu (P<0,05) este aumento. Tanto no córtex quanto na medula renal FK mais IBMX reduziram a oxidação de 14C-lactato, porém a hSTC-1 não alterou esse resultado. Conclusão: O presente trabalho demonstra a participação das hSTC-1 e hSTC-2 na regulação da atividade gliconeogênica a partir de 14C-lactato e de 14C-alanina no fígado de ratos alimentados e em jejum de 24h. Os resultados deste estudo mostram que a hSTC-1 regula o metabolismo do lactato no rim (córtex e medula) de ratos alimentados e em jejum de 48h. Além disso, os dados mostram que a hSTC-1 interfere na sinalização intracelular da via gliconeogênica mediada pelo cAMP no córtex renal.

Stanniocalcin (STC) is a glycoprotein hormone found in fish, but also present in mammals. There are two isoforms, STC-1 and STC-2, expressed in different organs, such as liver and kidneys, suggesting an important physiological contribution of STCs to metabolic pathways. During fasting, hepatic glycogen levels decrease and hepatic and renal gluconeogenesis become the main alternatives for maintaining plasma glucose levels. The aim of this study was to evaluate the role of human STC-1 and STC-2 hormones (hSTCs) in glucose and lactate metabolism in the liver and kidney of fed or fasted rats. Specifically in renal lactate metabolism, the aim was to determine the ability of hSTC-1 to modulate the 3', 5'- cyclic adenosine monophosphate (cAMP) signal in fed rats. Methods: Adult male Wistar rats (n = 120) were divided into three groups: 1) fed, which received water and a standard diet for rodents ad libitum; 2) fasted for 24 hours for hepatic gluconeogenesis study, and 3) fasted for 48 hours for renal gluconeogenesis study, which received water ad libitum and were individually housed. Animals were decapitated and stem blood was collected. The liver and kidneys were excised, sliced and used for in vitro experiments. The control groups were incubated without hSTCs hormones. Liver, renal cortex and medulla slices were incubated in Krebs Ringer Bicarbonate (KRB) pH 7.4 and Krebs Ringer Henseleit (KRH) pH 7.4, respectively. Liver slices were incubated in the presence of hSTC-1 and hSTC 2 at 3 .86pM and 38.6pM. Also, in the liver tissue, gluconeogenic activity from 14C-alanine and 14C-lactate, glucose oxidation, glycogen concentration, and glycogen synthesis from 14C-glucose of fed and fasting rats (24h) were evaluated.In addition, the hepatic expression of the Pck1 gene, and the genes Stc1 and Stc2, respectively, were determined. In kidneys, cortex and medulla slices were incubated in the presence of hSTC-1 at 0.386pM; 3.86pM; 386pM and 3860pM. Also, in the renal tissue, the effect of hSTC-1 on gluconeogenic activity from 14C-lactate, 14C-lactate oxidation and Pck1 gene expression were evaluated. The role of hSTC-1 in the stimulatory cAMP signal in renal gluconeogenesis of fed rats was evaluated. Data were expressed as the mean ± standard error of the mean and statistical analysis was performed according to Kolmogorov-Smirnoff normality tests. One- or two-way ANOVA were used to determine the significance of the differences. Gene expression and serological data of lactate metabolism were analyzed by unpaired Student's t-test. Differences were considered significant when P<0.05. The protocols were approved by the official Animal Ethical Committee (#29392) of Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Results: Liver – In the fed state, only the presence of Stc1 was detected; after 24-hour fasting, the Stc1 and Stc2 genes expression increased significantly (P<0.05). In the fed state, hepatic gluconeogenic capacity from 14C-alanine decreased with 38.6pM of hSTC-2, but it was accompanied by a reduction in Pck1 gene expression at 3.86 and 38.6pM. After 24-hour fasting, 38.6pM of hSTC-1 stimulated gluconeogenesis from 14C-lactate. Likewise, hSTC-2 at 3.86 and 38.6pM increased gluconeogenic activity from 14C-lactate in the liver of fasted rats. However, the increase in Pck1 expression occurred only in the presence of 3.86pM hSTC-2 in livers of fasted animals incubated with 14C-lactate. The hSTC concentrations used in this work did not significantly alter the oxidation capacity of 14C-glucose, glycogen concentration, and glycogen synthesis from 14C-glucose in the liver of fed or fasted rats. Kidney – Only 3860pM of hSTC-1 increased (P<0.05) the gluconeogenic capacity from 14C-lactate, as well as the expression (P<0.05) of Pck1 gene in the renal cortex of fed rats. Moreover, oxidation of 14C-lactate in renal cortex of fed rats was stimulated (P<0.05) by hSTC-1 at 0.386pM. Nevertheless, the hormone concentrations used in the present study did not modify the gluconeogenic activity and 14C-lactate oxidation in the renal cortex of fasting rats (48h). hSTC-1 did not alter gluconeogenesis or oxidation from 14C lactate in renal medulla of fed rats. However, 3.86pM of hSTC-1 increased (P<0.05) renal gluconeogenic activity from 14C-lactate, but did not increase (P>0.05) 14C-lactate oxidation or Pck1 gene expression in renal medulla of fasting rats (48h). Gluconeogenesis from 14C-lactate increased by 50% (P<0.05) when using 25µM of forskolin (FK) plus 2mM of 3-isobutyl-1 methylxanthine (IBMX), but 3.86pM of hSTC-1 inhibited (P<0.05) this increase in the renal cortex of fed rats. The concentrations of FK plus IBMX and hSTC-1 did not alter (P>0.05) gluconeogenesis activity in the renal medulla of fed rats. FK plus IBMX reduced oxidation of 14C-lactate; however, hSTC-1 did not change this parameter in either the cortex or the renal medulla. Conclusion: The present study is the first to demonstrate the participation of hSTC-1 and hSTC-2 in the regulation of gluconeogenic activity from 14C-lactate and 14C alanine in the liver of fed and fasted (24h) rats. The results of this study also reveal that hSTC-1 regulates lactate metabolism in the kidney of fed and 48 hour fasted rats. In addition, the data indicate that hSTC-1 act downstream of the adenyl cyclase pathway, decreasing the gluconeogenesis activity induced by cAMP intracellular increase or stimulating the phosphodiesterase activity in the renal cortex.