Sobrevivência in vitro de sêmen criopreservado equino e de ruminantes após indução à capacitação espermática e da reação acrossômica para aplicação na produção in vitro de embriões

Abstract

O objetivo deste estudo foi determinar a eficiência de um protocolo de indução de capacitação espermática e de reação acrossômica in vitro em sêmen criopreservado de espécies mamíferas domésticas para uso na fecundação in vitro (FIV), utilizando a espécie bovina como modelo e controle. No Experimento I, comparou-se o efeito de diferentes concentrações de heparina (5, 10 e 15 UI/mL) na indução da capacitação espermática (CE) in vitro do sêmen criopreservado das espécies bovina, bubalina, ovina, caprina e equina. Também se avaliou a resposta do sêmen bovino capacitado in vitro ao cálcio ionóforo (A23187) para a indução da reação acrossômica (RA) in vitro e, por fim, este foi utilizado para a FIV de oócitos bovinos sem zona pelúcida (ZP) para avaliar as taxas de fecundação monospérmica e polispérmica. No Experimento II, avaliou-se a resposta do sêmen equino criopreservado frente a concentrações maiores de heparina (50 e 100 UI/mL) e de cálcio ionóforo (A23187) para a indução da CE e da RA in vitro. A sobrevivência dos espermatozoides após o descongelamento, durante e após a incubação, a CE e a RA, foram avaliadas pelas colorações com azul de tripano-Giemsa, e com clortetraciclina (CTC), respectivamente. No Experimento I, a espécie bovina apresentou baixa mortalidade espermática após incubação (7 a 16%) e foi responsiva ao tratamento com heparina (59 a 84%), havendo diferença nas respostas dos touros frente à heparina (p<0,05), conforme esperado. As espécies bubalina, equina e ovina não responderam aos tratamentos com heparina (<20%) e apresentaram elevada mortalidade após a incubação com heparina (18 a 77%), havendo uma correlação negativa entra as taxas de mortalidade e a proporção de espermatozoides capacitados (p<0,05; r= -0,70). Já o sêmen caprino apresentou menor mortalidade (19 a 42%) e resposta moderada à heparina (14 a 31%). A FIV de oócitos bovinos sem ZP com espermatozoides bovinos após CE e RA in vitro resultou em maiores taxas de fecundação monospérmica (40%) e menores de polispermia (2%) em comparação à FIV convencional, com oócitos com ZP (24% e 18%, respectivamente; p<0,05). No Experimento II, dois de cinco garanhões mostraram ser mais sensíveis à heparina (10 a 30%) e ao cálcio ionóforo (A23187) para a indução da RA in vitro (52 a 67%), mas com elevadas taxas de mortalidade após a incubação (49 a 74%). Contudo, o protocolo aplicado no presente trabalho resultou na indução da capacitação espermática e reação acrossômica in vitro do sêmen equino criopreservado.

This study aimed to determine the efficiency of a protocol for the induction of in vitro sperm capacitation and acrosome reaction in frozen semen of domestic species for use in in vitro fertilization (IVF) procedures, using bovine semen as control. In Experiment I, the effect of different heparin concentrations (5, 10 and 15 IU/mL) on the induction of in vitro sperm capacitation (SC) of frozen bovine, bubaline, ovine, caprine and equine semen was compared. The response of capacitated frozen bovine semen to calcium ionophore (A23187) for induction of in vitro acrosome reaction (AR) was also evaluated, being used for the IVF of zona-free bovine oocytes to assess monospermic and polyspermic fertilization rates. In Experiment II, the response of frozen equine semen to heparin (50 e 100 IU/mL) and calcium ionophore (A23187) for induction of in vitro SC and AR was evaluated. Sperm survival rates after thawing, incubation, SC AR were evaluated by trypan blue-Giemsa and by chlortetracycline (CTC) stains, respectively. In Experiment I, bovine semen had low sperm mortality after incubation (7 to 16%) and high response to heparin (59 to 84%), with bulls showing different responses to heparin. Buffalo, equine and ovine semen did not respond to heparin treatments (<20% of capacited cells) and showed high cell mortality after incubation (18 to 77%), with a negative correlation observed between mortality and the proportion of capacitated sperm cells (p<0,05; r= -0.70). Goat semen, in turn, had moderate mortality (19 to 42%) and response to heparin (14 to 31%). The IVF of zona-free bovine oocytes with in vitro acrosome reacted bovine sperm resulted in higher monospermic fertilization rates (40%) and lower polyspermia (2%) than conventional IVF using intact oocytes (24% and 18%, respectively; p<0.05). In Experiment II, two out of five stallions responded to heparin (10 a 30%) and to calcium ionophore to induce AR in vitro (52 a 67%), with high mortality rates after incubation (49 to 74%). However, the protocol used in the present study resulted in the in vitro sperm capacitation and acrosome reaction of cryopreserved equine semen.