Câncer hereditário associado aos genes TP53, BRCA1 e BRCA2 : análises genômicas, funcionais e clínicas

Abstract

Aspectos genômicos, funcionais e clínicos de síndromes de predisposição hereditária ao câncer associadas aos genes TP53, BRCA1 e BRCA2 foram abordados nesta tese. No contexto do gene TP53, em que mutações germinativas causam Síndrome de Li-Fraumeni (SLF), nosso objetivo principal foi estudar as consequências funcionais e clínicas de algumas mutações encontradas em famílias brasileiras, especialmente a mutação fundadora R337H. Nossos resultados demostram que células normais (fibroblastos) de indivíduos portadores de mutações em TP53 caracterizam-se por alterações redox, com altos níveis de espécies reativas de oxigênio (ERO) associados a um processo persistente de reparo de DNA, provavelmente devido a um aumento do dano oxidativo. Também foi observada alta atividade no reparo de sítios apurínicos e apirimidínicos (sítios abásicos), um tipo de dano de DNA causado, principalmente, por ERO. Devido a bem estabelecida relação entre estresse oxidativo e inflamação, 28 marcadores inflamatórios, incluindo citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento, foram dosados em plasma de indivíduos portadores da mutação R337H e controles. Um aumento significativo na dosagem de IL-12, bem como uma tendência de maiores níveis de IL-8, IL-17 e IFN-y foram encontrados no grupo R337H, sugerindo atividade inflamatória. A fim de verificar o impacto de substâncias antioxidantes sobre o fenótipo bioquímico de estresse oxidativo, indivíduos portadores da mutação R337H e controles foram suplementados com N-acetilcisteína, Idebenona e Coenzima Q10, e parâmetros oxidativos foram avaliados antes e após o período de suplementação (14 dias). Nossos resultados apontam para um efeito da Coenzima Q10 e Idebenona na correção bioquímica de estresse oxidativo, visto que a suplementação com ambas substâncias foi capaz de diminuir os níveis de lipoperoxidação lipídica. Além dos estudos funcionais e clínicos acerca da mutação R337H, análises moleculares relacionadas ao papel de genes modificadores de fenótipo e de uma nova variante associada a SLF foram realizadas. Observamos que 7/129 (5.4%) indivíduos com fenótipo clínico de SLF/LFL e negativos para mutações em regiões codificantes de TP53 são portadores de uma nova variante germinativa rara, rs78378222[C]. Achados adicionais relacionados a conservação evolutiva e impacto funcional desta 10 variante, tanto em fibroblastos quanto em tumores, confirmam sua patogenicidade e apontam para um mecanismo de haploinsuficiência de p53. Além disso, também foi observado a contribuição de um polimorfismo na região promotora do gene MDM2 (SNP309) na idade do primeiro diagnóstico de câncer em portadores da mutação R337H. Já em relação ao conjunto de resultados relacionados à BRCA1 e BRCA2 apresentados nesta tese, 39 tumores de mama de pacientes com mutações germinativas nos genes BRCA1 (n=29) e BRCA2 (n=10) foram sequenciados no intuito de identificar o perfil de variação no número de cópias de DNA e mutações somáticas. A partir do sequenciamento massivo e paralelo foi possível concluir que a grande maioria destes tumores apresenta perda do alelo selvagem de BRCA1 ou BRCA2, sendo que este parece ser um evento inicial na carcinogênese da maioria destas neoplasias. Além disso, mutações clonais em TP53 foram observadas em uma parcela significativa dos casos, sendo estas, provavelmente, anteriores a perda do alelo selvagem de BRCA1/2. A identificação de tumores que preservam o alelo selvagem de BRCA1 ou BRCA2, ou ainda que perdem este de maneira subclonal, levanta questões sobre o impacto de novas drogas que apresentam como alvo terapêutico os mecanismos de recombinação homóloga.

In this work, we aimed to study genomic, functional and clinical aspects of cancer predisposition syndromes associated to germline mutations in the TP53, BRCA1 and BRCA2 genes. With regard to TP53, in which germline mutations are associated to Li-Fraumeni syndrome (LFS), we were mainly interested in understanding the clinical and biological consequences of TP53 germline mutations found in Brazilian families, with special attention to R337H mutation. Our results show that normal cells (fibroblasts) from LFS subjects have an hyperoxic phenotype characterized by high reactive oxygen species (ROS) levels, associated to a tendency for slower DNA repair and more persistent DNA damage. Interestingly, all mutant p53 fibroblasts showed higher repair activity of apurinic/pyrimidinic (AP) sites, a DNA lesion caused mainly by intensive ROS exposure. Given the well-described relationship between oxidative stress and inflammation, we then simultaneously quantified 25 cytokines, chemokines and growth factors in plasma of R337H mutation carriers and controls. We found significant higher levels of IL-12, as well as a tendency for increased IL-8, IL-17 and IFN-y, in mutation carriers when compared to controls, suggesting inflammatory activation. In order to verify the impact of antioxidants on oxidative stress, we supplemented R337H mutation carriers and controls with Nacetylcysteine, Idebenone and Coenzyme-Q10 and oxidative parameters were measured before and after supplementation period (14 days). Our findings highlight to a benefit of supplementation with Coenzyme Q10 and Idebenone, since that both were able to decrease lipid peroxidation in R337H mutation carriers group. In addition to functional e clinical studies presented here, we also aimed to study the impact of genetic modifiers on clinical manifestation of R337H carriers as well as the contribution of a new rare TP53 germline variant in LFS. In this context, we observed that 7 out of 129 (5.4%) subjects with clinical phenotype without TP53 germline mutations in the TP53 coding regions were carriers of a new functional variant, the rs78378222[C]. Further results related to the evolutionary conservation and functional impact of rs78378222[C] in both fibroblasts and in tumors confirm the pathogenicity of this variant and suggest a mechanism of haploinsufficiency. Finally, polymorphism analysis revealed an impact of the 12 MDM2 SNP309 on age at first tumor in R337H mutation carriers. Regarding BRCA1 and BRCA2, we sequenced 39 breast tumors from patients carrying BRCA1 (n=29) and BRCA2 (n=10) germline mutations in order to determine the repertoire of copy number alterations and somatic mutations of these tumors. By using ultra-deep sequencing of bulk-tumor and normal tissue, we observed that most of these tumors were characterized by somatic inactivation of BRCA1 and BRCA2 wild-type allele, which were likely to be an early genetic event in carcinogenesis. Moreover, TP53 somatic mutations were highly recurrent and all clonal, and we concluded that they likely precede BRCA1 or BRCA2 inactivation, as the latter was subclonal in some cases. The identification of tumors that preserved the BRCA1 or BRCA2 wild-type allele at all, or in which loss of the wildtype allele was restricted to subpopulations of cancers cells, raises concerns regarding response to drugs targeting homologous recombination deficiency in these tumors.