Avaliação funcional de uma manoproteína predita de Cryptococcus gattii na arquitetura capsular e na interação com o hospedeiro

Abstract

O principal fator de virulência das leveduras do gênero Cryptococcus é a produção de uma cápsula polissacarídica composta por glucuronoxilomanana (GXM), galactoxilomanana (GalXM) e manoproteínas. Os polissacarídeos GXM e GalXM já foram e continuam sendo extensivamente caracterizados em relação a suas estruturação, produção e participação na virulência, mas não existem relatos sobre a função das manoproteínas nas estruturação/montagem da cápsula de Cryptococcus spp. e pouco se sabe sobre seu papel na virulência da levedura. Considerando isso, o presente estudo teve como objetivo caracterizar a função de uma manoproteína predita de C. gattii, codificada pelo gene CNBG4278, através de perda e ganho de função de mutantes nulo e de superexpressão, respectivamente. A partir de análises por microscopia eletrônica de varredura (MEV), foi verificado que a montagem da cápsula do mutante nulo é distinta daquela da linhagem selvagem, porém não há diferença no tamanho da cápsula sintetizada por ambas. Células do mutante nulo são mais sensíveis ao agente estressor de parede Congo Red e apresentam aumento de secreção de GXM ao sobrenadante de cultivo em relação à linhagem selvagem, podendo indicar um possível defeito no ancoramento do polissacarídeo à parede celular. Testes de fagocitose in vitro demonstraram que a deleção do gene codificador da manoproteína predita diminui a eficiência com a qual as células são fagocitadas por macrófagos J774.A1 nas primeiras horas de interação e aumenta a taxa de replicação intracelular do fungo. Entretanto, os mutantes nulo e de superexpressão não apresentaram diferença de virulência em modelo murino de criptococose. Além disso, a manoproteína recombinante expressa em Escherichia coli é reconhecida por soro de pacientes infectados com Cryptococcus spp. Nossos resultados indicam que a manoproteína predita CNBG4278 de C. gattii afeta a estrutura da parede celular e consequentemente a montagem da cápsula, mas não é essencial para virulência do fungo in vivo.

The major Cryptococcus virulence factor is the production of a polysaccharide capsule composed by glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM) and mannoproteins (MPs). The GXM and GalXM polysaccharides were and still are extensively characterized in aspects related to its structuration, production, and virulence participation, however there is no data on mannoproteins role in capsule structure/assembly and little is known about its participation in the yeast virulence. Considering this, the present study aimed to characterize the function of a predicted mannoprotein from C. gattii, coded by CNBG4278 gene, through the loss and gain of function of null and overexpression mutants, respectively. Analysis of Scanning Electron Microscopy (SEM) demonstrated that the capsule assembly in the null mutant strain is distinct from that observed in WT cells, but there is no difference in the size of the synthesized capsule among the strains. Also, null mutant cells are more sensitive to the cell wall stressor Congo Red and have increased GXM secretion to the culture supernatant compared to wild type, indicating a possible defect in the polysaccharide anchoring to the cell wall. In vitro phagocytosis tests showed that the deletion of the predicted mannoprotein coding gene affects phagocytosis by J774.A1 macrophages in the early hours of interaction and increases the yeast intracellular replication rate. However, the null and overexpression mutants showed no difference in virulence in a murine model of cryptococcosis. Furthermore, sera from patients with cryptococcosis recognized the recombinant mannoprotein expressed in Escherichia coli. Together, our results indicate that the predicted mannoprotein CNBG4278 from C. gattii affects the cell wall structure and therefore the capsule assembly, but is not essential for virulence in vivo.