Caraterização fenotípíca e molecular de cepas de Pasteurella multocida

Abstract

Entre as bactérias que habitam a cavidade oral e nasal dos animais, os constituintes da família Pasteurellaceae estão entre os microrganismos comensais ou oportunistas mais prevalentes. Apesar do número de doenças associadas e da diversidade de hospedeiros acometidos, o conhecimento sobre a patogenia desta bactéria ainda é restrito. Além disto, a análise da virulência de Pasteurella multocida, que ocasiona casos agudos e crônicos de cólera aviária, não é comum. Tais estudos são ainda mais raros para cepas circulantes no Brasil. O objetivo deste trabalho foi a caracterização fenotípica e molecular de 96 cepas de P. multocida isoladas de aves e de suínos no país. As subespécies e os biovares foram determinados através de testes bioquímicos, e os sorogrupos foram classificados pelo emprego de testes fenotípicos não sorológicos. A susceptibilidade in vitro a nove antimicrobianos também foi avaliada. Para os estudos genotípicos, foi realizada a pesquisa de 22 genes de virulência por multiplex-PCR, incluindo-se aqueles determinantes dos sorogrupos, a comparação dos perfis genéticos e a diferenciação molecular através de PCR-RFLP a partir dos genes ompH e oma87. Por último, os testes fenotípicos e moleculares para classificação dos sorogrupos foram comparados, e a distribuição dos genes foi relacionada com índices de patogenicidade in vivo das cepas para a identificação de marcadores moleculares. Um total de 87,5% (84/96) das cepas foi classificado na subespécie multocida. O biovar 3 foi o mais comum entre as cepas aviárias e suínas, sendo identificado respectivamente em 35,7% (20/56) e 25% (10/40) dos casos. Entre as cepas aviárias, 90,7% (49/54) foram classificadas no sorogrupo A através do multiplex-PCR, e 3,7% (2/54) não foram classificados em um dos dois sorogrupos. Em contraste, somente 75,9% (41/54) das cepas aviárias foram identificadas no tipo capsular A através do teste fenotípico e 20,4% (11/54) não foram tipificadas. Resultados semelhantes foram observados entre os isolados suínos. As taxas de susceptibilidade das cepas aviárias foram superiores a 80% para os antimicrobianos testados, com exceção à enrofloxacina e ao sulfafurazol. Somente amoxicilina, ciprofloxacina e gentamicina inibiram o crescimento de mais de 80% das cepas suínas. 8,9% (5/56) dos isolados de origem aviária e 37,5% (15/40) das cepas suínas foram multirresistentes. A maioria dos genes (ompH, oma87, psl, plpB, exbD-tonB, fur, hgbA, nanH, nanB, sodA, sodC, pmHAS, ptfA) apresentou uma frequência superior a 90% e distribuição regular, independentemente da origem. As cepas foram agrupadas em 33 perfis, sendo o perfil 1 (toxA-; pfhA-; dcbF-; bcbD-; hsf-1- ) o mais frequente, identificado em 16,7% (16/96) dos casos. O PCR-RFLP a partir do gene ompH permitiu a classificação das cepas aviárias em sete grupos moleculares, sendo predominante o grupo II, identificado em 42,9% (24/56) das situações. A detecção do gene pfhA indica a presença de cepas de alta patogenicidade em aves, e em segundo lugar, de cepas intermediárias. Este estudo proveu a caracterização fenotípica e molecular de cepas de P. multocida isoladas de aves e de suínos no Brasil e os seus resultados possibilitam a distinção futura dos isolados aviários quanto à patogenicidade.

The constituents of the Pasteurellaceae family are among the most prevalent commensal microorganisms or opportunistic pathogens that inhabit the oral and nasal cavity of the animals. The knowledge of the pathogenesis of this bacterium is still restricted, despite the number of related diseases and diversity of affected hosts. Similarly, analysis of the virulence of Pasteurella multocida, that causes acute and chronic cases of fowl cholera, is not common. Such studies are even rarer for the circulating strains in Brazil. The present work aimed to the phenotypic and molecular characterization of ninety-six P. multocida strains isolated from poultry and swine in the country. The subspecies and biovars were determined through biochemical scheme and the serogroups or capsular types were classified by employing non-serologic phenotypic tests. Furthermore, the susceptbility to nine antimicrobial agents was evaluated. For genotypic studies, the investigation of twenty-two virulence genes by multiplex-PCR, including those that are serogroups determinants, the comparing of the genetic profiles and the molecular differentiation by PCR-RFLP from ompH e oma87 were performed. Finally, the results of phenotypic and molecular tests for classification of serogroups were compared and the distribution of genes was related to in vivo pathogenic indices of strains for identification of molecular markers. 87.5% (84/96) of the strains were classified in multocida subspecies. The biovar 3 was more common among avian and swine strains, identified respectively in 35.7% (20/56) and 25% (10/40) of cases. Among avian strains, 90.7% (49/54) were classified in serogroup A by multiplex-PCR and 3.7% (2/54) were not classified in one of two serogroups. In contrast, only 75.9% (41/54) of avian strains were identified in the capsular type A through phenotypic test and 20.4% (11/54) were not typed. Similar results were observed among swine isolates. The susceptibility rates of avian strains were above 80% for the tested antimicrobials, except to enrofloxacin and sulfafurazol. Only amoxicillin, gentamicin and ciprofloxacin inhibited the growth of more than 80% of the swine strains. 8.9% (5/56) of avian isolates and 37.5% (15/40) of swine strains were multidrug-resistant. The majority of genes (ompH, oma87, psl, plpB, exbD-tonB, fur, hgbA, nanH, nanB, sodA, sodC, pmHAS, ptfA) had a frequency higher than 90% and regular distribution, regardless of source. The strains were grouped in 33 profiles and profile 1 (toxA-; pfhA-; dcbF-; bcbD-; hsf-1-) was most frequent, identified in 16.7% (16/96) of cases. The PCR-RFLP from ompH gene allowed the classification of avian strains in seven molecular groups. The predominant group II was identified in 42.9% (24/56) of cases. The detection of pfhA gene indicates the presence of highly pathogenic avian strains, and secondly, of intermediate strains. This study provided the phenotypic and molecular characterization of P. multocida isolated from poultry and swine in Brazil and its results enable future distinction of avian strains according the pathogenicity.