Detecção de fatores de virulência e resistência antimicrobiana em estirpes de Campylobacter spp. em isolados humanos e de matadouros-frigoríficos de aves na Região Sul do Brasil

Abstract

Campilobacteriose é uma zoonose de distribuição mundial, com repercussões importantes na saúde pública e um grande impacto socioeconômico. O objetivo deste estudo foi investigar a ocorrência, padrões de resistência antimicrobiana e sua relação fenotípica e genotípica, bem como a caracterização de marcadores de virulência em isolados de Campylobacter spp. obtidos a partir de fontes de origem aviária de diferentes pontos na linha do abate de matadouros-frigoríficos do Estado do Rio Grande do Sul. Um total de 141 amostras, incluindo fezes (n=8), água de chiller (n=18), carcaças de frango durante o processo do abate (n=26) e carne de frango pronta para o consumo (n=89) foram avaliadas. Todos os isolados foram confirmados pela técnica m-PCR baseados na detecção da região 16S rRNA e os genes ceuE e mapA. Determinou-se a presença de Campylobacter jejuni em 140 amostras (99.2%), enquanto que Campylobacter coli foi identificado na amostra restante (0,7%). Cento e quarenta e uma cepas de Campylobacter spp. foram submetidas à analise de PCR para a detecção de marcadores de resistência e as 140 de Campylobacter jejuni para avaliar genes de patogenicidade. Em referência a Campylobacter jejuni, os resultaram indicaram que o gene flaA estava presente em 78.5% e o marcador cadF foi detectado em 77.8% dos isolados. Do total das amostras 85% (119/140) foram detectados para o gene cdtA, 80% (112/140) para o gene cdtB e 92.1% (129/140) para o gene cdtC. O operon (cdtABC) associado com a expressão total da toxina citoletal estava presente em 74.2% (104/140) das amostras. O marcador genético associado à invasão (iam) não foi encontrado em nenhum dos isolados de Campylobacter jejuni, e a ocorrência dos genes virB11 e wlaN foi de 22.1% e 10.7%, respectivamente. Na pesquisa de resistência a antimicrobianos, uma alta porcentagem (65%) (91/141) dos isolados de Campylobacter spp. são resistentes a β-lactâmicos. Cinquenta cepas (35.5%) são resistentes a tetraciclinas e 26 (18.5%) tem a presença da bomba de efluxo. Neste contexto, 36 de 141 cepas de Campylobacter (25.6%) são resistentes a dois diferentes marcadores de resistência (blaOXA-61 e tetO). Realizou-se também outro estudo, para detectar a mutação no gene gyrA da região determinante de resistência a quinolonas (QRDR). Um total de 50 amostras de Campylobacter jejuni foram submetidas a testes de sensibilidade mediante ensaios genotípicos e fenotípicos. A Concentração Inibitória Mínima (CIM) foi determinada utilizando a técnica de microdiluição em caldo. Os resultados obtidos mostraram uma porcentagem de 98% sensíveis a eritromicina. Em contraste, 94% de Campylobacter jejuni isolados foram resistentes à ciprofloxacina (47/50) e quarenta e cinco cepas (90%) resistentes ao ácido nalidíxico. Em referência aos isolados resistentes à ciprofloxacina, 100% das estirpes apresentavam relação entre o fenótipo de resistência e uma mutação no aminoácido 86 do gene gyrA, sendo detectada pelo ensaio de PCR-RFLP e posteriormente confirmada por sequenciamento. Os resultados deste estudo mostram uma grande diversidade entre os isolados analisados. O esforço para reduzir as infecções por Campylobacter spp. em humanos está diretamente ligado a uma melhor compreensão dos aspectos biológicos deste microrganismo e, particularmente, dos seus mecanismos de virulência e resistência, que contribuem na patogênese da doença.

Campylobacteriosis is a zoonosis of worldwide distribution, with important implications for public health and a significant socioeconomic impact. The aim of this study was to investigate the occurrence, antimicrobial resistance patterns and phenotypic and genotypic relationship of Campylobacter species. A total of 141 samples, including feces (n = 8), chiller tank processing water (n = 18), carcasses during the slaughter process (n = 26) and poultry meat (n = 89) were evaluated. All the isolates were confirmed by m-PCR based detection of 16SrRNA, ceuE and mapA genes. The most ubiquitous of the thermotolerant Campylobacter spp. was C. jejuni. It was found in 140 of the contaminated samples (99.2%), whereas C. coli was identified in the remaining sample (0.7%). One hundred and forty-one strains of Campylobacter spp. analysis were subjected to PCR for the detection of resistance markers and 140 Campylobacter jejuni strains to evaluate pathogenic genes. In reference to Campylobacter jejuni, the obtained results showed that, the occurrence of flaA gene was 78.5% and cadF gene 77.8% in the isolates. The cytotoxin encoding cluster cdtABC was detected in 74.2% isolates. The frequency rates found for cdtA, cdtB and cdtC was 85%, 80%, and 92.1% respectively. The invasion-associated marker (iam) gene was not found in any of the Campylobacter isolates, and the occurrence of plasmidial virB11 and wlaN genes were 22.1%, and 10.7%, respectively. The results obtained point to the high percentage (65%) of Campylobacter isolates resistant to β-lactam. Fifty strains (35.5%) were resistant to tetracycline and 26 (18.5%) to the efflux pump. Moreover, 36 out of the 141 Campylobacter strains (25.6%) were found to be resistant to at least two different antimicrobial resistance markers (blaOXA-61 and tetO). Also, a total of 50 samples were screened for presence of antimicrobial sensibility for genotypic and phenotypic methods. Determination of Minimal Inhibitory Concentration (MIC) is tested using the standard microdilution method. The MICs results to 3 antimicrobial agents analyzed, showed that 98% of isolates were sensitive to erythromycin. In contrast, most isolates were resistant to ciprofloxacin (94%) and nalidixic acid (90%). Regarding ciprofloxacin-resistant isolates, 100% of the phenotype resistance strains had a mutation in the gyrA gene that was detected by the PCR-RFLP assay and sequencing. The results of this study show a great diversity among the isolates analyzed. The effort to reduce infections by Campylobacter spp. in humans is directly linked to a better understanding of the biological aspects of this microorganism and, particularly, its virulence and resistance mechanisms that contribute to the pathogenesis of the disease.