Efeito da suplementação com L-glutamina na forma livre e como dipeptídeo, L-alanil-L-glutamina em ratos submetidos a protocolo experimental de imobilização de membros : implicações sobre a degradação do conteúdo proteico muscular mediada pela ativação das vias de sinalização celular NF-kB, p38 MAPK, FOXO3a e papel citoprotetor da proteina HSP70

Abstract

Períodos de inatividade ou desuso da musculatura esquelética, em decorrência de situações, incluindo, imobilização de membros, têm sido associados a redução da tensão sobre os músculos, menor resistência à fadiga, redução no conteúdo proteico, diâmetro da fibra e da produção de força muscular. Adicionalmente, indivíduos submetidos a períodos de desuso da musculatura esquelética, podem ser acometidos por uma série de fisiopatologias secundárias, dentre elas, uma maior incidência de infecções, fato que, além de retardar a sua recuperação, contribui para a elevação da morbidade e, até mesmo, para um maior grau de mortalidade, entre esta população. Perfazendo cerca de 20% do pool total de aminoácidos livres no plasma e entre 50% a 60% no músculo esquelético, a glutamina é o aminoácido livre mais abundante no organismo, sendo a musculatura esquelética, o seu principal sítio de síntese, estoque e liberação endógena. Entretanto, sob condições de estresse fisiológico, incluindo câncer, sepse e exercícios físicos intensos, prolongados ou exaustivos, entre outras, ocorre considerável redução na disponibilidade de glutamina corporal, fato que decorre de um desequilíbrio entre a síntese e o consumo deste aminoácido, pelo organismo. Tal fato tem se correlacionado, de forma direta, ao desencadeamento de ações desagregadoras a homeostasia celular, incluindo a ativação de vias de sinalização celular com potencial proteolítico e pró-apoptótico, como as do fator nuclear Kappa B (NF-kB), da proteína quinase ativada por mitógenos (MAPK), subunidade p38 (p38 MAPK) e do fator transcricional Forkhead box O, subunidade 3a (FOXO3a) em decorrência de um desequilíbrio no estado redox celular, advindo da elevada síntese de espécies reativas de oxigênio (ERO), em relação a sua neutralização pelo sistema antioxidante celular, situação conhecida como estresse oxidativo. Por estas razões, a suplementação com L-glutamina, tanto na forma livre, conjugada com L-alanina (solução GLN+ALA), bem como na forma de dipeptídeos contendo este aminoácido, como o L-alanil L-glutamina (DIP) tem sido investigada, por representar uma maneira eficiente de fornecimento de glutamina, por via oral, ao organismo. Logo, no presente estudo, ratos Wistar machos adultos, foram submetidos a um período de 14 dias de imobilização bilateral dos membros posteriores, por meio de um novo modelo experimental de imobilização de membros e suplementados, concomitantemente, de maneira oral, com DIP (1,49 g/Kg-1/d, grupo DIP-IMOB) e com a solução contendo os aminoácidos L-glutamina (1 g/Kg-1/d) e Lalanina (0,61 g/Kg-1/d) na forma livre (grupo GLN+ALA-IMOB) ou água (grupo IMOB). Parâmetros basais foram obtidos de animais não imobilizados e suplementados com DIP (grupo DIP), GLN+ALA (grupo GLN+ALA) e água (grupo CONTR), na mesma posologia dos grupos submetidos a imobilização. Os animais foram sacrificados 10 horas após a última sessão de gavagem, onde o plasma e os músculos sóleo e gastrocnêmio foram coletados para análise. No plasma, foram mensuradas as concentrações de glutamina, glutamato, amônia, fator de necrose tumoral-α (TNF-α), cortisol, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e a concentração de glutationa (GSH) e dissulfeto de GSH (GSSG), nos eritrócitos. Nos músculos sóleo e gastrocnêmio foram analisadas as concentrações de glutamina, glutamato, GSH, GSSG, razão GSSG/GSH, TBARS, proteínas carbonilas, TNF-α, caspase 3 e o imunoconteúdo de NF-kB, heterodimero p65, IKKα/β, p38 MAPK e FOXO3a, nas suas isoformas total e fosforilada, bem como o imunoconteúdo total, de HSP70. Ainda nos músculos sóleo e gastrocnêmio, foram analisados o conteúdo proteico e área de secção transversa miofibrilar, bem como parâmetros morfológicos, incluindo: peso corporal total, % de ganho de peso durante o período experimental, peso muscular total, relação peso muscular/peso corporal total e o grau de atrofia e/ou % de alteração do peso muscular, de ambos os membros submetidos a imobilização. Quartoze dias de imobilização de membros promoveram significativa redução da concentração de glutamina no plasma e nos músculos sóleo e gastrocnêmio de animais IMOB, quando comparados aos grupos basais do estudo. Tal situação foi atenuada e reestabelecida nos grupos DIP-IMOB e GLN+ALA-IMOB (p<0,05), fato que atenuou a redução de GSH e seu estado redox (razão GSSG/GSH) em eritrócitos circulantes e nos respectivos músculos esqueléticos (p<0,05). A concentração plasmática e muscular de TNF-α, bem como as concentrações de cortisol no plasma, TBARS no plasma e músculos, proteínas carbonilas e caspase 3, nos músculos sóleo e gastrocnêmio foram significativamente elevadas durante o período de imobilização, em animais IMOB, fato que foi atenuado pelo emprego de ambas as formas de suplementação com GLN, administradas no presente estudo (p<0,05). Igualmente, 14 dias de imobilização dos membros posteriores, induziram significativo aumento no imunoconteúdo de NF-kB, heterodimero p65, IKKα/β, p38 MAPK e FOXO3a, nas suas isoformas total e fosforilada, ao mesmo tempo em que se observou significativa redução no imunoconteúdo, total, de HSP70, nos músculos sóleo e gastrocnêmio, de animais IMOB. Por outro lado, ao mesmo tempo em que promoveu significativo aumento no imunoconteúdo de HSP70, ambas as suplementações com DIP e/ou com a solução GLN+ALA atenuaram a expressão proteica de NF-kB p65, IKKα/β, p38 MAPK e FOXO3a, isoformas total e fosforilada, em ambos os músculos analisados, em animais GLN+ALA-IMOB e DIP-IMOB. Em conlusão, os resultados do presente estudo demonstram que a suplementação por via oral com L-glutamina, tanto na forma de DIP, quanto na forma de solução GLN+ALA, configura-se em alternativa nutricionalmente eficaz, no intuito de se atenuar a redução dos estoques de glutamina corporal, em ratos submetidos a 14 dias de desuso ou inatividade da musculatura esquelética, por meio de imobilização de membros. Tal efeito demonstra estar associado, ao aumento da capacidade de defesa antioxidante, mediada pelo eixo glutamina-glutationa, menor processo inflamatório e danos a proteínas teciduais, bem como a redução da expressão proteica de constituintes chaves, de vias de sinalização celular com potencial proteolítico e próapoptótico, em detrimento de significativo aumento na expressão proteica da proteina citoprotetora HSP70.

Periods of inactivity or skeletal muscle disuse by situations including limb immobilization have been associated with reduced muscle tension, protein content, fiber diameter and muscle strength production even as, lower muscle fatigue resistance. Additionally, individuals undergoing to skeletal muscle disuse periods may be affected by a series of secondary pathophysiology, among them, a higher incidence of infections, which, in addition to delaying their recovery, contributes to increased morbidity even as, for a higher degree of mortality among this population. Making up about 20% of the total pool of free amino acids in plasma and among 50% to 60% in skeletal muscle, glutamine is the body’s most abundant free amino, being skeletal muscle its main site of synthesis, stock and endogenous release of this amino acid to the body. However, under stressfull physiological conditions, including cancer, sepsis and intense, prolonged or exhaustive physical exercise, among others, there is a considerable reduction in the availability of body glutamine, fact that results from an imbalance among the synthesis and body needs of this amino acid. This fact has been directly correlated to the triggering of disintegrating actions to cellular homeostasis maintenance, including the activation of cell signaling pathways with proteolytic and pro-apoptotic potential, such as the nuclear factor Kappa B (NF-kB), mitogen-activated kinase, subunit p38 (p38 MAPK) and the transcriptional factor Forkhead box O, subunit 3a (FOXO3a), due to an imbalance in the cellular redox state resulting from increased synthesis of reactive oxygen species (ROS), regarding its neutralization by the cellular antioxidant system, a situation known as oxidative stress. For these reasons, supplementation with Lglutamine, both in free form, conjugated to L-alanine (GLN+ALA solution), as well as dipeptides containing this amino acid, such as L-alanyl-L-glutamine (DIP) has been investigated as an efficient way to deliver glutamine to the body. That way, in the present study, adult male Wistar rats were subject to 14-days period of bilateral hindlimb immobilization, using a new experimental model of limb immobilization and, orally supplemented with DIP (1.49 g/kg-1/d, DIP-IMOB group) and with a solution containing the amino acids L-glutamine (1g/kg-1/d) and L-alanine (0.61g/kg-1/d) in their free forms (GLN+ALA-IMOB group) or water (IMOB group). Baselines parameters were obtained from non-immobilized and supplemented with DIP (DIP group), GLN+ALA solution (GLN+ALA group) and water (CONTR group) animals, in the same dosage of the immobilized groups. The animals were sacrificed 10 hours after the last gavage session, where plasma and the soleus and gastrocnemius muscle were collected for analysis. Plasma concentrations of glutamine, glutamate, ammonia, tumor necrosis factor-α (TNF-α), cortisol, thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) were measured even as, glutathione (GSH) and GSH disulfide (GSSG) concentrations were measured in erythrocytes. Glutamine, glutamate, GSH, GSSG, GSSG/GSH ratio, TBARS, carbonyl proteins, TNF-α, caspase 3 and the immunecontent of NF-kB, heterodimer p65, IKKα/β, p38 MAPK and FOXO3a in their total and phosphorylated isoforms, as well as the total immunecontent of HSP70 were analyzed in soleus and gastrocnemius muscle. Morphological parameters including: protein content and myofibrillar cross-sectional area as well as, total body weight, % of weight gain during the experimental period, total muscle weight and muscle weight/body weight ratio and the degree of atrophy and/or % change in muscle weight of both limbs subjected to immobilization period were analyzed, equally in soleus and gastrocnemius muscle. Fourteen days of hindlimb immobilization promoted a significant reduction in glutamine concentration in plasma and in soleus and gastrocnemius muscle of IMOB animals, compared to the baselines groups. This situation was attenuated and reestablished in the DIP-IMOB and GLN+ALA-IMOB rats (p<0.05), which attenuated the reduction of GSH and its redox state (GSSG/GSH ratio) in circulating erythrocytes even as, in skeletal muscle (p<0.05). Plasma and muscle TNF-α concentrations as well as, plasma cortisol, plasma and muscle TBARS, carbonyl protein and caspase 3 concentrations were significantly higher in soleus and gastrocnemius muscle in IMOB animals, which was attenuated by the both GLN supplementation forms administered in the present study (p<0.05). Equally, 14-days of hindlimb immobilization induced a significant increase in the immunecontent of NF-kB, heterodimer p65, IKKα/β, p38 MAPK and FOXO3a, in their total and phosphorylated isoforms, at same time that a significant decrease in immunocontent of HSP70 was observed in the soleus and gastrocnemius muscles of IMOB animals. On the other hand, both oral supplementation with DIP and/or GLN+ALA solution promoting a significant increase in HSP70 immunocontent, fact that reverberated in attenuated total and phosphorylated NF-kB p65, IKKα/β, p38 MAPK and FOXO3a protein expression, in both muscle analyzes in GLN+ALA-IMOB and DIP-IMOB animals. In conclusion, the results of the present study demonstrate that oral L-glutamine supplementation, either in DIP and/or GLN+ALA solution form, if configure in a nutritionally effective alternative to mitigate the reduction of body glutamine stores in rats subjected to 14 days of disuse or inactivity of skeletal muscles through limb immobilization. This effect has been shown to be associated with increased antioxidant defense capacity mediated by the glutamine-glutathione axis, lower inflammatory process and damage to tissue proteins as well as, reduced protein expression of key constituents of proteolytic and pro-apoptotic cell signaling pathways, in detriment of a significant increase in cytoprotective HSP70 protein expression.