Glicogenoses hepáticas : o microbioma intestinal como fator de influência

Abstract

Introdução: O microbioma é o conjunto de microrganismos, metabólitos, genes e ambiente no qual estão inseridos. O microbioma interage com o hospedeiro através de processos metabólicos e imunes, sendo influenciado pela dieta, genética, idade, níveis hormonais, medicamentos e geografia. O desequilíbrio da microbiota intestinal (disbiose) está associado a doenças frequentes nas glicogenoses hepáticas (GSD), tais como obesidade, doença inflamatória intestinal (IBD), diabetes, osteoporose e esteato-hepatite não alcóolica. As GSD, uma classe de erros inatos do metabolismo (EIM), são doenças genéticas raras do metabolismo do glicogênio. Esta tese foca nas GSD-Ia (G6PC), GSD-Ib (SLC37A4), GSD-III (AGL) e GSD-IX (PHAK), as quais são caracterizadas por defeitos na rota de degradação e são majoritariamente tratadas por intervenção dietética, com restrição de carboidratos de hidrólise rápida e administração frequente e periódica de amido de milho cru (AMC). Objetivo: Caracterizar a relação entre microbioma intestinal e erros inatos do metabolismo, com ênfase nas glicogenoses hepáticas. Metodologia: O estudo foi desenvolvido em quatro etapas. Etapa 1: revisão não sistemática da literatura tanto sobre microbiota intestinal e EIM, quanto microbiota e as classes de tratamentos mais utilizados nos EIM. Etapa 2: estudo experimental, transversal, controlado, com amostragem de conveniência, incluindo 24 pacientes geneticamente diagnosticados com GSD em tratamento com AMC e 16 controles hígidos. Os participantes deveriam ter idade ≥ 3 anos, sem sinais de infecção, não ter sido vacinado nos 15 dias antecedentes às coletas ou estar em tratamento com antibióticos, não ter sido indicado ou recebido transplante de órgãos. Controles deveriam ter mesmo sexo e idade similar (±1 ano) aos pacientes. Amostras fecais e de sangue foram coletadas, e adicionalmente os participantes preencheram um registro alimentar de três dias e responderam a um questionário clínico. O DNA bacteriano fecal foi extraído e realizou-se o sequenciamento parcial do gene 16S rRNA na plataforma Ion Torrent. Os dados do sequenciamento foram curados segundo a metodologia do BMP, classificados taxonomicamente, analisados em ambiente R (pacotes vegan 13 e phyloseq) e com o software MicrobiomeAnalyst. Os nutrientes da dieta foram quantificados com o software Nutribase e o pH fecal foi aferido com pHmetro eletrônico. A calprotectina fecal foi quantificada com kit comercial do tipo ELISA segundo as instruções do fabricante. Etapa 3: estudo experimental, transversal, controlado, com amostragem de conveniência, incluindo 27 pacientes (GSD-Ia=16, GSD-Ib=06, GSD-III=02, GSD-IX=03) e 24 controles. Os critérios de inclusão foram os mesmos utilizados na etapa 2. Após a coleta de sangue dos participantes, 20 citocinas plasmáticas (G-CSF, GM-CSF, IFNy, GRO, IL-10, MDC, IL-13, IL-17A, IL-1α, IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MIP1α, MIP-1β, TNFα, TNFβ e VEGF) foram quantificadas com kit comercial Multiplex Cytokine Assay (Luminex). Pacientes GSD-I, III e IX foram comparados aos controles, e os tipos de GSD foram comparados entre si, considerando características clínicas. Etapa 4: Análise in silico através de redes de IPP, utilizando-se os identificadores SLC37A4, G6PC, G6PC2, G6PC3, ITGAL, ITGAM, S100A8 e S100A9 como dados de entrada na ferramenta STRING. O software CytoScape foi utilizado para a análise de módulos, medidas de centralidade, ontologias e para a construção de redes secundárias de interação. Resultados: Etapa 1: Um dos principais fatores de associação entre microbioma intestinal e EIM é a dieta/tratamento, que normalmente é restrita e/ou sobrecarregada de forma específica nos EIM. Além disso, o microbioma intestinal possui forte associação com o fígado e cérebro, dois órgãos mais afetados nos EIM. Etapa 2: pacientes possuem uma menor diversidade e estrutura do microbioma fecal diferente dos controles em vários níveis taxonômicos. Pacientes apresentaram prevalência maior (p≤0,05) de IBD, obesidade/sobrepeso, consumo de medicamentos e calorias (majoritariamente do AMC) do que o grupo controle. Além disso, pacientes consumiam menos gorduras, cálcio, sódio e vitaminas, e apresentaram pH fecal mais ácido. A riqueza microbiana teve correlação com o pH (r=0,77; p=6,8e-09), consumo de carboidratos totais (r=0,6; p=4,8e-05) e açúcar (r=0,057; p=0,00013). Etapa 3: pacientes apresentaram níveis reduzidos (p≤0,05) de IL-4, MIP-1α, MDC, TNF-β e VEGF em comparação aos controles. Entre os pacientes, os níveis de citocinas diferiram (p≤0,05) conforme o tipo de GSD, presença de anemia, adenoma e níveis de triglicerídeos. Etapa 4: Nas redes de interação exclusivas da GSD-Ia, várias proteínas se conectaram aos nós 14 centrais. Dentre as proteínas, selecionou-se como de interesse TLR4, ITGAL, ITGAM, IL-6 e IL-10, os quais podem exercer um importante papel na interação entre microbiota, sistema imune e saúde do hospedeiro dentro do contexto das GSD. Conclusões: Pacientes com GSD hepática apresentam disbiose intestinal e um desequilíbrio na imunomodulação. Através das redes IPP foi possível identificar que as interações proteicas provavelmente alteradas na GSD-Ia compreendem proteínas relacionadas ao sistema imune, as quais podem atuar como moduladores na interação entre microbioma e hospedeiro.

Introduction: The microbiome is defined as the entire habitat, including the microorganisms, their genomes and the surrounding environmental conditions. The gut microbiome interacts with the host mainly through metabolic and immunological processes and can be affected by several factors, such as diet, host genetics, age, sex, medicines, and geographic factors. Dysbiosis, an imbalance in the gut microbiome, is related to several multifactorial diseases like obesity, inflammatory bowel disease (IBD), diabetes, osteoporosis and non-alcoholic fatty liver disease, which is commonly developed by patients with hepatic glycogen storage diseases (GSD). GSD are rare genetic diseases, a class of inborn errors of metabolism (IEM) that affect glycogen metabolic pathways. This study focuses on GSD-Ia (G6PC), GSD-Ib (SLC37A4), GSD-III (AGL) and GSD-IX (PHKA), all of them with an impaired degradation pathway. These GSD are mainly treated by dietetic intervention, restriction of fast-hydrolysis carbohydrates and frequent and periodic ingestion of uncooked cornstarch (UCCS). Objectives: To characterize the relation between the intestinal microbiota and IEM, with emphasis on hepatic GSD. Methods: This study was developed in four phases. Phase 1: Non-systematic review of studies about the gut microbiota and IEM, as well as the gut microbiota and the most common treatments for IEM. Phase 2: Experimental, cross-sectional, controlled study with 24 patients genetically diagnosed for hepatic GSD on UCCS treatment and 16 healthy controls sampled by convenience. As inclusion criteria, subjects should be 3 years or older, not presenting signs of infection, not vaccinated 15 days prior to samples collection, not be on antibiotics, not have been designated to receive or received organ transplant. Controls should be of similar sex and age (±1 year) to the patients. Fecal and blood samples were collected and subjects filled a three-day food record and answered a clinical questionnaire. After fecal DNA extraction and partial 16S rRNA sequencing, results were analyzed according to the BMP recommendations, taxonomically classified, analyzed on R environment (phyloseq and vegan packages) and Microbiome Analyst software. The nutrient intake was estimated through the Nutribase software, and the pH was measured by an electronic pH-meter. Fecal 16 calprotectin quantification was performed through commercial ELISA kit. Phase 3: Experimental, cross-sectional, controlled study with 27 patients with genetic diagnosis for hepatic GSD on UCCS treatment (Ia=16, Ib=6, III=2, IX=3) and 24 healthy controls sampled by convenience. The inclusion criteria were the same as used in phase 2. Subjects collected 5 mL of blood and 20 blood cytokines (G-CSF, GM-CSF, IFNy, GRO, IL-10, MDC, IL-13, IL-17A, IL-1α, IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MIP1α, MIP-1β, TNFα, TNFβ e VEGF) were quantified through a multiplex assay kit. Patients (I, III and IX) were compared with controls, and the GSD types were compared taking into account clinical features. Phase 4: In silico analysis of PPI networks using the identifiers/interactors SLC37A4, G6PC, G6PC2, G6PC3, ITGAL, ITGAM, S100A8 and S100A9 as input on STRING. CytoScape software was used to analyze modular structure, centrality measures and gene ontology terms. Results: Phase 1: The main factor of association between IEM and the gut microbiome is the diet/treatment, which is restricted/overloaded in a specific way on IEM. The gut microbiota has strong association with the liver and the brain, two of the most affected organs on IEM. Phase 2: The GSD microbiome was characterized by low diversity and distinct microbial structure. Patients had higher prevalence of IBD and overweight/obesity, usage of medicines, higher calories’ intake, mainly due the UCCS, and lower intake of fat, calcium, sodium, and vitamins than controls. Patients presented lower fecal pH than controls. The OUT abundance was correlated with fecal pH (r=0.77; p=6.8e-09), total carbohydrate (r=-0.6; p=4.8e-05) and sugar (r=0.057; p=0.00013) intakes. Phase 3: Patients presented reduced (p≤0.05) levels of IL-4, MIP-1α, MDC, TNF-β and VEGF. Cytokine level were different among patients according to GSD type (p≤0.05), presence of anemia, adenoma and triglyceride levels. Phase 4: The merged PPI network corresponding GSD-Ia exclusive network presented several interactions among immune system components. As interesting interactors were identified TLR4, ITGAL, ITGAM, IL-6 and IL-10. Conclusion: The GSD patients presented dysbiosis and an imbalance on immunomodulation. Through PPI networks it was possible to identify that altered PPI in GSD-Ia involving several proteins related to innate immune system, which can act as modulators on host-microbiome interaction.