A caveolina-1 como reguladora fisiológica na ativação de células estreladas hepáticas : um novo modelo in vitro de doenças hepáticas

Abstract

As caveolas e os rafts lipídicos são importantes plataformas de sinalizações, nas quais aglomerados de proteínas e alguns lipídios fazem o correto posicionamento para intensificar a qualidade da amplificação da sinalização. A caveolina-1 (Cav-1) é uma proteína estrutural, presente em todas as organelas e tipos celulares, conhecida por fazer ligações com outras proteínas, sendo importante na homeostase do colesterol, endocitose, migração, respiração celular, transcitose, autofagia, ativação e adesão celular. O aumento da expressão de Cav-1 em fígados cirróticos e doenças hepáticas crônicas mostra a importância do controle da homeostase desta proteína. A célula estrelada hepática (HSC) é a principal responsável por produzir proteínas de cicatrização ou matriz extracelular fibrótica (MEC) em lesões hepáticas, expressando marcadores clássicos de ativação, tais como: alfa actina de musculo liso (αSMA), colágeno do tipo I (Col-I) e proteína glial fibrilar ácida (GFAP). Neste estudo, desenvolvemos duas linhagens permanentes derivadas das células GRX, um conhecido modelo murino de HSC, uma que superexpressa a proteína Cav-1, denominada GRXEGFP-Cav1 e outra silenciada para Cav- 1, a GRXGFPshCav1. Primeiro, mostramos que a superexpressão de Cav-1 foi suficiente para ativar as células GRXEGFP-Cav1 e com isso propomos que a Cav-1 possa ser um potencial marcador molecular para ativação das HSCs. A seguir, mostramos que a superexpressão de Cav-1 favoreceu a formação de culturas de esferoides 3D, ativando rotas de apoptose e necrose celular, diminuindo a migração celular a partir do esferoide. Por fim, mostramos que tanto a superexpressão quanto o silenciamento de Cav-1 foi capaz de aumentar parâmetros de respiração celular ligada ao ATP, mudar morfologia das redes mitocondriais e das mitocôndrias e modular as interações entre membrana mitocondrial (MAM) e retículo endoplasmático (RE). Em suma, nesta tese, mostramos o envolvimento da Cav-1 na fisiologia da ativação das HSC. Por fim, os resultados obtidos, nos permitem propor que desenvolvemos e caracterizamos um novo modelo in vitro de HSC ativadas para os estudos de doenças hepáticas.

Caveolas and lipid rafts are important signaling platforms, in which protein clusters and some lipids are correctly positioned to enhance the quality of signaling amplification. Caveolin-1 (Cav-1) is a structural protein, present in all organelles and cell types, known to make connections with other proteins and is important in cholesterol homeostasis, endocytosis, migration, cellular respiration, transcytosis, autophagy, activation. and cell adhesion. Increased Cav-1 expression in cirrhotic livers and chronic liver diseases shows the importance of controlling this protein's homeostasis. The hepatic stellate cell (HSC) is primarily responsible for producing fibrotic extracellular matrix (ECM) in liver damage, expressing classic activation markers such as smooth muscle alpha actin (αSMA), type I collagen (Col-I) and acid fibrillar glial protein (GFAP). In this study, we developed two permanent GRX cell-derived strains, a known murine model of HSC, one is exogenous expressing of Cav-1 called GRXEGFP-Cav1 and another knockdown for Cav- 1, GRXGFPshCav1. First, we showed that exogenous expression of Cav-1 was sufficient to activate GRXEGFP-Cav1 cells and therefore we propose that Cav-1 could be a potential molecular marker for HSC activation. Next, we show that exogenous expression of Cav- 1 favored the formation of 3D spheroid cultures, activating apoptosis and cell necrosis routes, reducing cell migration from the spheroid. Finally, we showed that both exogenous expression of and knockdown of Cav-1 were able to increase ATP-linked cellular respiration parameters, change mitochondrial and mitochondrial network morphology, and modulate interactions between mitochondrial membrane (MAM) and endoplasmic reticulum (RE). In summary, in this thesis, we show the involvement of Cav- 1 in the physiology of HSC activation. Finally, the results allow us to propose that we develop and characterize a new in vitro model of activated HSC for liver disease studies.