Uso de DNA barcode para identificação de espécies de palmito como ferramenta para a genética forense

Abstract

O palmito pode ser obtido de diferentes espécies de palmeiras. Compõe-se basicamente das folhas não desenvolvidas imediatamente acima do meristema apical, responsável pelo desenvolvimento da palmeira. Atualmente, o Brasil é responsável por 95% da produção mundial de palmito e também é um grande consumidor. A maior parte da produção de palmito vem das palmeiras do gênero Euterpe. Devido à ampla distribuição natural e alta densidade populacional, a espécie Euterpe edulis Mart. e Euterpe oleracea Mart. foram exploradas para este fim em um nível predatório. Essa exploração contribui para a degradação do meio ambiente e tornou-se um fator preocupante para a preservação, principalmente, de E. edulis, uma vez que não há rebrotação, pois apresenta um único caule. O presente estudo é uma iniciativa para reforçar a necessidade de um programa de regulação baseado na identificação por DNA barcode de espécies comercializadas irregularmente como palmito em conserva nos mercados do Sul do Brasil. Os DNA barcode geralmente se referem a sequências curtas de DNA, que podem ser usadas para identificar espécies com rapidez e precisão. Além da identificação das espécies, os DNA barcode também podem melhorar ou complementar a taxonomia tradicional baseada em caracteres morfológicos. Um barcode ideal deve obedecer a três critérios: universalidade, facilidade de amplificação e sequenciamento; qualidade da sequência; e poder discriminatório. Neste estudo, o objetivo geral foi distinguir quatro espécies utilizadas como palmito (E. edulis, E. oleraceae, Bactris gasipaes e Archontophoenix cunninghamiana) tanto in natura quanto em palmito em conserva. Como recomendado pelo CBOL Plant Working Group, foram avaliados os marcadores individualmente e também combinados. Foram utilizados três marcadores de cloroplasto, candidatos a DNA barcode: rps16-trnk, trnL-trnF e rpl32-trnL, e o marcador nuclear: ITS2, para comparar as quatro espécies de acordo com o sucesso da amplificação, poder de discriminação e divergência inter e intraespecífica.Os resultados mostraram que o marcador rpl32-trnL pode ser usado individualmente como um barcode, bem como marcadores concatenados para distinguir essas espécies de plantas, enquanto que para animais somente o COI (cytocrome oxydase I) é necessário. A alta qualidade e pureza do DNA isolado de produtos processados são fatores essenciais para a identificação de espécies e podem afetar a análise. Neste estudo, dois métodos foram principalmente testados para a extração de DNA: Dnaesymericon Food Kit e o método CTAB com modificações; após, as etapas de amplificação e sequenciamento foram realizadas. Além disso, os principais fatores que influenciam o sucesso da amplificação por PCR são o tamanho do fragmento amplificado e o status de processamento do alimento, que pode envolver superaquecimento dos tecidos, compostos químicos, tempo de armazenamento e contaminação, causando degradação do DNA. Fragmentos curtos e produtos não processados resultam em taxas de sucesso mais altas. No que diz respeito ao marcador ITS2, este pôde ser amplificado para todas as espécies processadas deste estudo, mas sequenciado apenas para E. edulis, E. oleraceae e Bactris gasipaes. 6 Para o marcador trnL-trnF, apenas as amostras processadas de E. oleraceae foram amplificadas e sequenciadas com sucesso, e somente para este marcador o método baseado na árvore de NJ pôde ser realizado com sucesso. A implementação de tais programas regulatórios usando tecnologias inovadoras, como os métodos de identificação baseados em DNA, pode desencorajar a substituição deliberada no mercado de palmito e levar a uma redução significativa na rotulagem errada do produto.

Heart-of-palm can be harvested from different species of palms. It is basically composed of the unexpanded leaves immediately above the apical meristem, responsible for the development of the palm tree. Currently, Brazil is accountable for 95% of the world production of palm heart, and is also a major consumer. Most of the heart-of-palm production comes from palms of the Euterpe genus. Due to wide natural distribution and high population density, the species Euterpe edulis Mart. and Euterpe oleracea Mart. have been exploited for this purpose in a predatory level. This exploitation contributes to the degradation of the environment and has become a concern factor for the preservation, mainly, of E. edulis, since there is no regrowth, as it presents a single stem. Here we report an initiative to enforce a regulatory program based on DNA Barcode identification of mislabeled palm heart products commercialized in Southern Brazil market places. DNA barcodes generally refer to short DNA sequences, which can be used to rapidly and accurately identify species. Besides species identification, DNA barcodes have also been deemed to improve or supplement traditional taxonomy based on morphological characters. An ideal barcode must conform to at least three criteria: universality, ease of amplification and sequencing; sequence quality; and discriminatory power. In this study, we attempted to distinguish four species used as palm heart (E. edulis, E. oleraceae, Bactris gasipaes and Archontophoenix cunninghamiana) both in natura and processed palm heart. As recommended by the CBOL Plant Working Group, we avaliated not only individual markers, but also the combination of them as plant barcode. Our method includes three chloroplast markers, candidates as DNA barcode markers: rps16-trnk, trnL-trnF and rpl32-trnL, and the nuclear marker: ITS2, to compare the four species according to amplification success, discrimination power and inter- and intra-specific divergence. Our results showed that rpl32-trnL can be used individually as a barcode as well as concatenated markers to distinguish plant species, while for animals only the COI (cytocrome oxydase I) is needed. High quality and purity of DNA isolated from processed products is essential for species identification and has unpredictable influences and effect the analysis. In this study, two mainly methods were tested for DNA extraction: Dnaesymericon Food Kit and CTAB method with modifications, and then the amplification and sequencing steps were performed. Moreover, main factors influencing the success of PCR amplification are the size of the amplified fragment and the processing status of the food, that may involve overheating of tissue, chemical compounds, time of storage and contamination, causing DNA degradation. Short fragments and unprocessed products result in higher success rates. Concerning ITS2 marker, it could be amplyfied for all the processed species of this study, but sequenced only for E. edulis, E. oleraceae and Bactris gasipaes. For the trnL-trnF marker, only the processed samples of E. oleraceae could be successfully amplified and sequenced, and only for this marker the NJ tree-based method could be performed with success. The implementation of such regulatory 8 programs using innovative technologies, such as DNA based identification methods, may discourage deliberate replacement in the palm heart market and lead to a significant reduction in palm heart mislabeling.