Metabolismo de alcaloides e flavonoides em culturas de Rhodophiala bifida (Amaryllidaceae) e Trifolium pratense (Fabaceae)

Abstract

A família Amaryllidaceae apresenta variedades ornamentais com alto interesse comercial e um grupo de compostos chamados Alcaloides de Amaryllidaceae, que apresentam comprovadas atividades biológicas. Devido à baixa produção de compostos relacionados ao metabolismo secundário, são procuradas alternativas para o aumento da produção pois opções como a síntese química total se tornam bastante onerosas. Sendo que uma grande parte dos alcaloides produzidos por essas plantas é obtida por meio de extratos com plantas cultivadas, as culturas de tecido in vitro surgem como uma opção interessante. A Fabaceae é a terceira maior família de plantas, com grande diversidade na produção de metabolitos secundários. As investigações fitoquímicas revelaram que esta família é composta por plantas com metabólitos secundários chamados de isoflavonas, compostos fenólicos conhecidos por suas atividades fitoestrógenas. Dessa forma, buscando estudar plantas de ambas as famílias, optou-se pela utilização de Rhodophiala bifida, com grande biossíntese da molécula montanina e Trifolium pratense, que também é conhecido pelos altos níveis de isoflavonas. Assim, nas plantas de R. bifida, buscou-se promover a regeneração dos bulbos, realizar as análises fitoquímicas quali e quantitativas, buscar sequencias relativas a dois genes relacionados à biossíntese da montanina, analisar a expressão destes genes nos diferentes tecidos e tipos de cultivo nos quais cresceram estas plantas e determinar a melhor forma de cultivo dentre as avaliadas. Para as plantas de T. pratense, o objetivo foi introduzir as plantas no cultivo in vitro, produzir culturas celulares e de raízes, realizar as análises fitoquímicas qualitativas e quantitativas do conteúdo presente nas culturas e promover a elicitação das diferentes linhagens de culturas de raízes, determinar a melhor forma de cultivo dentre as estudadas. Assim, realizou-se a coleta de bulbos de R. bifida Assim, realizou-se a coleta de bulbos de R. bifida em três anos consecutivos e posteriormente, foi estabelecido o protocolo para cultivo in vitro, com os bulbos de uma destas coletas, a regeneração ocorreu via organogênese direta, com a multiplicação e crescimento das plantas, elas passaram por aclimatização e o cultivo em casa de vegetação, assim como a reintrodução em solo dos bulbos coletados, foi também desenvolvido protocolo para germinação de sementes de R. bifida in vitro. Com estas amostras, realizou-se a quantificação de montanina e a identificação dos alcaloides presentes nas plantas selvagens, da mesma forma, promoveu-se a identificação e caracterização de dois genes importantes da rota biossintética das Amaryllidaceae, o 4OMT e CYP96. Ao final, os maiores incrementos da produção de montanina foram encontrados em plantas selvagens cultivadas em casa de vegetação, com condições controladas, e a identificação das moléculas presentes nas plantas de R. bifida, assim como os genes da rota de biossíntese destas plantas, são importantes informações para o aperfeiçoamento de estudos futuros com as mesmas. Nos estudos relacionados ao T. pratense, coletou-se as plantas selvagens e as sementes, as quais, foram germinadas in vitro, cultivadas e a partir das plântulas, desenvolveu-se protocolos de culturas celulares e culturas de raízes transformadas com A. rhizogenes. Com estas amostras foram realizadas as análises quantitativas das isoflavonas principais, daidzeína, genisteína, formononetina e biochanina A, assim como o conteúdo total destas. As amostras de culturas de raízes tiveram seus isoflavonóides identificados e foram elicitadas com sacarose e ácido salicílico para a visualização dos incrementos ou diminuições dos conteúdos ao se utilizar estas moléculas. Por fim, concluiu-se que dentre todos os modos de cultivo avaliados, nas culturas celulares detectou-se menores quantidades de isoflavonas enquanto os melhores resultados foram encontrados nas culturas de raízes quando elicitadas com sacarose 60 g L-1. Considerando-se em conjunto, os resultados encontrados em todo o estudo contribuem para o desenvolvimento de estudos visando a preservação destas plantas, promovendo sistemas de produção in vitro ou em casa de vegetação, com maior rendimento das moléculas de interesse.

The Amaryllidaceae family has ornamental varieties of high commercial interest and a group of compounds called Amaryllidaceae alkaloids, which have proven biological activities. Due to the low production of compounds related to secondary metabolism, alternatives are sought for the increase of the production because options like the total chemical synthesis become quite onerous. Since a large part of the alkaloids produced by these plants is obtained by means of extracts with cultivated plants, in vitro tissue cultures appear as an interesting option. Fabaceae is the third largest family of plants, with great diversity in the production of secondary metabolites. Phytochemical investigations revealed that this family is composed of plants with secondary metabolites called isoflavones, phenolic compounds known for their phytoestrogenic activities. In order to study plants of both families, Rhodophiala bifida, which produces montanine and Trifolium pratense, which is also known for yielding high levels of isoflavones. Thus, in the plants of R. bifida, we tried to promote the regeneration of bulbs, to carry out the qualitative and quantitative photochemical analyzes, to look for the sequences of two genes related to the biosynthesis of montanine, to analyze the expression of these genes in different tissues and types of cultivation in which these plants were grown and to determine the best form of cultivation. For T. pratense plants, the objective was to introduce the plants to in vitro cultivation, to produce cell and hairy root cultures, to carry out the qualitative and quantitative phytochemical analysis of the said cultures to promote elicitation of the different hairy root lineages and determine the best form of cultivation. Thus, the harvest of R. bifida bulbs in field was carried out in three consecutive years and the protocol for in vitro cultivation was established with the bulbs of one of these harvests. Regeneration occurred via direct organogenesis, with the multiplication and growth of the plants which underwent acclimatization and greenhouse cultivation followed by reintroduction of the bulbs in soil, a protocol was also developed for germination of R. bifida seeds in vitro. With these samples, the quantification of montanine, as well as identification of the alkaloids present in the wild plants were carried out the identification and characterization of two important genes of the biosynthetic route of Amaryllidaceae, 4OMT and CYP96, was done. Largest increases in montanine production were found in wild plants grown under greenhouse conditions. The identification of the molecules presents in R. bifida plants, as well as some of the genes of the biosynthesis route of these metabolites constitute important information for future studies with this important class of plants. In the studies related to T. pratense, wild plants were harvested, they were germinated in vitro, grown and from the seedlings protocols of cell cultures and roots cultures transformed with A. rhizogenes were developed. With these samples, the quantitative analyzes of the main isoflavones, daidzein, genistein, formononetina and biochanin A, as well as their total content were carried out. Root culture samples had their isoflavonoids identified and were elicited with sucrose and salicylic acid. It was concluded that in all the evaluated culture modes, cell cultures had smaller amounts of isoflavones and the best yeilds were found in root cultures when elicited with sucrose 60 g L-1. Taken together, results found throughout this research contribute to the development of protocols at the preservation of these plants, promoting alternatives to their production in vitro or in greenhouse, providing systems for increased supply of the molecules of interest.