Cepas de Enterobacter hormaechei produtoras de NDM-1 : análise de antibacterianos in vitro e em Galleria mellonella e mecanismos de adesão envolvidos na formação de biofilme

Abstract

A emergência de cepas de produtoras de carbapenemases é uma realidade em vários países, incluindo o Brasil. Estudos anteriores mostraram a habilidade de cepas do complexo Enterobacter cloacae em adquirirem o gene blaNDM-1 (New Delhi metalo β-lactamase). Devido à importância clínica deste gênero o objetivo do presente trabalho foi investigar fatores de virulência envolvidos no processo de adesão e na formação de biofilme em cepas de Enterobacter hormaechei subsp. oharae produtoras de NDM-1. O modelo de biofilme em macrocolônia foi utilizado para avaliar a suscetibilidade e a formação de biofilme das diferentes subpopulações geradas pela macrocolônia. In vitro, o perfil de suscetibilidade e a avaliação do sinergismo entre os antibacterianos (meropenem, rifampicina e polimixina B) foram determinados pelos métodos de concentração inibitória mínima (MIC) e checkerboard, respectivamente. Larvas de Galleria mellonella foram utilizadas para verificar a eficácia da terapia antibacteriana in vivo. A detecção de genes fimbriais foi feita pela técnica de PCR e a expressão das fimbrias tipo 1 e tipo 3 foi determinada por ensaios de aglutinação com diferentes eritrócitos na presença de manose. Para os experimentos de adesão celular, células epiteliais de bexiga (ATCC® 5637) foram infectadas com bactérias e a contagem de unidades formadoras de colônia foi determinada. Por fim, a construção de mutantes para as fímbrias foi realizada por troca alélica e o sequenciamento do DNA bacteriano foi feito em plataforma Illumina. As quatro subpopulações originadas da macrocolônia 798F (denominadas de 798-1S, 798-2S, 798-3S e 798-4S) apresentaram diferenças na formação de biofilme e na resposta ao tratamento com antibacterianos. Somente as subpopulações que produziam a fimbria tipo 3 (798-1S e 798-2S) foram capazes de formar biofilme, mostrando a importância desta fimbria na formação de biofilme de cepas de E. hormaechei subsp. oharae. As duas subpopulações (798-1S e 798-4S) avaliadas in vivo mostraram diferentes respostas à terapia com antibacterianos. Em uma das subpopulações (798-4S) a terapia tripla com meropenem, rifampicina e polimixina B e a monoterapia com meropenem foram capazes de aumentar a sobrevivência das larvas, entretanto, nenhum dos tratamentos testados mostrou efeito nas larvas infectadas com 798-1S. Outro achado interessante foi a discrepância encontrada entre os resultados de suscetibilidade aos antibacterianos in vitro e in vivo. A polimixina B não foi capaz de aumentar a sobrevida das larvas embora as subpopulações fossem suscetíveis in vitro. Apesar do efeito sinérgico da combinação tripla in vitro, ela só teve efeito contra 798-4S in vivo. Por outro lado, o tratamento com meropenem foi capaz de aumentar a sobrevivência das larvas inoculadas com 798-4S apesar da resistência in vitro. Devido à importância das fímbrias no processo de adesão bacteriana e na formação do biofilme, o papel desses fatores de virulência foi avaliado. De acordo com o ensaio de aglutinação aos eritrócitos, nove isolados de E. hormaechei subsp. oharae expressavam a fimbria tipo 1 e, apenas dois (798F e 977F) expressavam a fímbria tipo 3. As cepas mutantes para fímbria tipo 1 (997FΔfim) e para a fimbria tipo 3 (798FΔmrk) não foram capazes de formar biofilme em placa de poliestireno provando que ambas desempenham um papel fundamental na formação do biofilme. Entretanto, estas cepas mutantes não apresentaram diferenças na adesão às células epiteliais da bexiga quando comparadas às cepas selvagens. Importante ressaltar que as cepas de E. hormaechei subsp. oharae mostraram uma alta capacidade de adesão celular. O resultado do sequenciamento do DNA dos isolados 7F, 798F e 997F, juntamente com a análise do perfil dos plasmídeos, sugerem que o operon mrkABCDF, responsável pela codificação da fimbria tipo 3, esteja localizado em um plasmídeo. Com os resultados deste estudo podemos concluir que (i) macrocolônias de E. hormaechei subsp. oharae são capazes de gerar subpopulações com diferenças relacionadas à virulência e à resposta ao tratamento; (ii) os métodos utilizados para determinação da suscetibilidade in vitro apresentam limitações podendo levar à falha terapêutica; (iii) as fimbrias tipo 1 e tipo 3 são fundamentais para a formação de biofilme em placa de poliestireno; (iv) a habilidade em adquirir plasmídeos que codificam genes de virulência e/ou de resistência a antibacterianos confere benefícios ao gênero Enterobacter o que pode justificar sua alta prevalência em infecções bacterianas.

Emergence of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae represents a concern in many countries, including Brazil. Previous studies have shown that members of the Enterobacter cloacae complex are able to acquire resistance genes as blaNDM-1 (New Delhi metalo β-lactamase). Considering the clinical relevance of this genus the aim of this study was to evaluate virulence mechanisms involved in bacterial adhesion and biofilm formation of NDM-1 producing Enterobacter hormaechei subsp. oharae strains. Macrocolony model was used to evaluate susceptibility profile and ability to form biofilm in different subpopulations generated by the macrocolony. In vitro, antimicrobial susceptibility and synergistic effect of meropenem, rifampicin and polymyxin B alone or combined were determined by minimum inhibitory concentration and checkerboard, respectively. Galleria mellonella model was used to evaluate antimicrobial therapy efficacy in vivo. Fimbrial genes were investigated by PCR and type 1 and type 3 fimbriae expression was determined by specific agglutination of red blood cells from different animal species with mannose. Cell adhesion assay was performed with human bladder cancer-derived epithelial cell line ATCC® 5637 infected with bacteria and the number of colony forming units was calculated. Finally, fimbriae mutants were constructed by allelic exchange and whole-genome sequencing was performed using Illumina equipment. The four subpopulations generated from 798F macrocolony, termed as 798-1S, 798-2S, 798-3S e 798-4S, showed differences regarding biofilm formation and response to antimicrobial therapy. Only subpopulation expressing type 3 fimbriae (798-1S and 798-2S) were able to form biofilm, highlighting the importance of these fimbriae in biofilm formation of E. hormaechei subsp. oharae strains. Two subpopulations (798-1S e 798-4S) were evaluated in G. mellonella model and showed different antimicrobial therapy results. In 798-4S, triple therapy with meropenem, rifampicin and polymyxin B and meropenem alone were able to increase larvae survival; none of the treatment was effective against larvae infected with 798-1S. We also observed discrepancies between in vivo and in vitro antimicrobial susceptibility. Polymyxin B did not enhance larvae survival despite susceptible profile in vitro. Triple combination presented synergistic effect in vitro against 798-1S and 798-4S but, this treatment was not able to enhance survival rates in larvae infected with 798-1S. On the other hand, monotherapy with meropenem was able to increase the survival of larvae infected with 798-4S besides in vitro resistance. Because fimbriae are involved in bacterial adhesion to biotic and abiotic surfaces and are also important for biofilm formation we decided to study the role of these virulence mechanisms in E. hormaechei subsp. oharae strains. According, hemagglutination results, the nine clinical isolates evaluated expressed type 1 fimbriae whereas only two isolates (798F e 977F) expressed type 3 fimbriae. Type 1 fimbriae mutant (997FΔfim) and type 3 fimbriae mutant (798FΔmrk) did not produce biofilm in 96 well polystyrene plate proving that these fimbriae are essential for biofilm formation. However, the mutant strains did not show differences on adhesion to bladder epithelial cells comparing with wild type strains. It is important to highlight that E. hormaechei subsp. oharae strains showed a high ability to adhere to these cells. Genome sequencing and plasmid profile of 7F, 798F and 997F isolates suggest that type 3 fimbriae operon mrkABCDF is located on a plasmid. Taken together, these results indicate that (i) E. hormaechei subsp. oharae macrocolonies were able to generate subpopulations with distinct virulence and response to antimicrobial therapy characteristics; (ii) in vitro antimicrobial susceptibility testing methods showed limitations and may lead to therapeutic failure; (iii) type 1 and type 3 fimbriae are essential for biofilm formation in polystyrene plate; (iv) the ability to acquire plasmids encoding virulence and antimicrobial resistant genes confers benefits to Enterobacter genus and may explains its high prevalence in bacterial infection.