Avaliação do papel desempenhado por vesículas extracelulares derivadas de glioblastoma na modulação do sistema imune e na progressão tumoral

Abstract

O glioblastoma (GBM) é o mais maligno e com a menor taxa de sobrevida dos tumores gliais. O tecido tumoral é composto por muitas células neoplásicas em proliferação, fibroblastos e células do sistema imune. A proliferação tumoral depende de uma rede complexa de fatores, como citocinas, adenosina e vesículas extracelulares (VEs). O papel das VEs ainda é um assunto controverso e sua atividade pró-tumoral ou antitumoral não é totalmente compreendida. Neste contexto, o objetivo desse trabalho foi compreender o papel das vesículas extracelulares derivadas de tumores (VETs), derivadas da linhagem celular C6, na modulação do sistema imune e na progressão do GBM. VETs foram isolados por centrifugação diferencial do sobrenadante da linhagem celular C6. O tamanho e a polidispersão foram analisados por equipamentos Nanosight, ZetaSizer e Microscopia Eletrônica de Transmissão. A estabilidade das VETs foi analisada pelo equipamento ZetaSizer nos dias 1, 4 e 18. Estas vesículas foram caracterizadas pela presença de marcador clássico, como CD9, e também pela presença das enzimas CD39 e CD73. Além disso, as células de GBM C6 foram tratadas com diferentes concentrações de VETs durante 96 h (n = 3) e a viabilidade celular foi avaliada por ensaio MTS. Em seguida, as VETs foram incubadas (8 μg) com linfócitos mesentéricos isolados de ratos Wistar adultos. Após 48 h de incubação, a expressão das enzimas CD39 e CD73 nos linfócitos foi avaliada por citometria de fluxo. Os modelos GBM in vivo foram realizados com três grupos de ratos Wistar machos adultos: Controle, coinjeção e imunização. No grupo de coinjeção, as VETs foram coinjetadas com células C6 GBM no estriado por cirurgia estereotáxica. No grupo de imunização, os ratos foram tratados com 20 μg de VETs 10 e 5 dias antes da cirurgia. Após 14 dias de crescimento tumoral, os ratos foram decapitados e o cérebro foi removido para quantificação do volume do tumor e análise do microambiente tumoral. As VETs apresentaram tamanho uniforme (175,2 ± 6,14nm) e a estabilidade, a 4 ° C, durante os 18 dias testados. Os inibidores das enzimas CD39 e CD73 reduziram (52,1% e 57,8%, respectivamente) a formação de ADO, enquanto o efeito do bloqueio do receptor ADO não alterou a concentração deste nucleosídeo. A porcentagem de células viáveis foi significativamente reduzida após o tratamento com 16 e 32 μg / mL de VETs (de 120 ± 2,12% para 82,52 ± 5% e 92,1 ± 7,9%, respectivamente). A incubação de linfócitos T com VETs não alterou a expressão da proteína CD39 e CD73 em nenhum dos subtipos testado de linfócitos T. Além disso, a coinjeção de VETs reduziu o tamanho do GBM de 221 ± 65,1 mm³ para 121 ± 40,6 mm³ em comparação ao controle. O grupo imunização apresentou um menor volume de GBM em comparação ao grupo controle (de 173 ± 91,8 mm³ para 69 ± 20,2 mm³). Buscando entender o mecanismo por trás dessa redução, analisamos a presença de células CD4+FOXP3- e CD4+FOXP3+ no microambiente tumoral. O grupo coinjeção mostrou uma redução significativa de células CD4+FOXP3- e CD4+FOXP3+, no entanto, não observamos o mesmo no grupo de imunização, que não mostrou diferença entre os grupos. Juntos, nossos resultados sugerem que os VETs desempenham um papel antitumoral na progressão do GBM, reduzindo a proliferação tumoral e a presença de linfócitos T regulatórios no microambiente tumoral.

Glioblastoma (GBM) is the most malignant with the poorest survival rate of the glial tumors. The tumoral tissue is composed by many proliferating neoplastic cells, fibroblasts and cells of immune system. Tumor proliferation depends on complex network factors, such as cytokines, adenosine and extracellular vesicles (EVs). The role of EVs remains controversial and their pro-tumoral or antitumoral activity is not fully understand. In this context, the aim of this study was understand the role of tumor-derived extracellular vesicles (TEVs) in the immune system modulation and GBM progression. TEVs were isolated by differential centrifugation of C6 cell line supernatant. Size and polydispersity were analyzed by Nanosight, Zetasizer equipments and Transmission Electron Microscopy. TEVs stability was analyzed by Zetasizer equipment on days 1, 4 and 18. These vesicles were characterized by the presence of EVs classical marker, CD9, also CD39 and CD73 enzymes. Further, C6 GBM cells were treated with different concentrations of TEVs during 96 h (n=3) and cell viability was assessed by MTS assay. Then, GEVs were incubated (8 μg) with mesenteric lymphocytes isolated from adult Wistar rats. After 48 h of incubation, the expression of CD39 and CD73 enzymes was evaluated by flow cytometry. The in vivo GBM model was performed with three adult male Wistar rats groups: Control, coinjection and immunization. In the coinjection group, TEVs were coinjecting with C6 GBM cells into the striatum by stereotactic surgery of adult Wistar rats. In the immunization group, rats were treated with 20 μg of TEVs 10 and 5 days before surgery. After 14 days of tumor growth, the rats were decapitated and the entire brain was removed for tumor size quantification and tumor microenvironment analysis. TEVs presented uniform size (175,2±6,14nm) and the stability, at 4°C, during the 18 days tested (186,8±6,64nm). Inhibitors of CD39 and CD73 enzymes reduces (52,1% and 57,8%, respectively) formation of ADO while the effect of ADO receptor blockade did not alter the concentration of this nucleoside. The percentage of viable cells was significantly reduced after treatment with 16 and 32 μg/mL of TEVs (from 120±2,12% to 82,52±5% and 92,1±7,9%, respectively). The incubation of T-lymphocytes with TEVs did not alter the expression of CD39 and CD73 protein in any tested subset of T-lymphocytes. Moreover, the co-injection of TEVs reduces the GBM size from 221 ± 65,1 mm³ to 121± 40,6 mm in comparison to GBM group. Immunization group reduces the GBM size from 173 ± 91,8 mm³ to 69 ± 20,2 mm³. Seeking to understand the mechanism behind this reduction, we analyzed the presence of CD4+FOXP3- and CD4+FOXP3+ cells in tumor microenvironment. The coinjection group showed a significant reduction of CD4+FOXP3- and CD4+ FOXP3+ cells, however we didn’t observe the same in immunization group, which has shown no difference between groups. Together, our results suggest GEVs plays an anti-tumoral role in GBM progression by reducing tumor proliferation and presence of T regulatory lymphocytes in tumor microenvironment.