Desenvolvimento de um método rápido para detecção de Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) em cromatografia liquida [sic] acoplada a espectrometria de massas (LC-MS/MS)

Abstract

Enterobacterales resistentes aos carbapenêmicos (ERC) foram reconhecidas como uma ameaça urgente à saúde global que causam a maioria das infecções de difícil tratamento em estabelecimentos de saúde e estão associadas a elevada mortalidade. ERCs produtoras de Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC), principalmente Klebsiella pneumoniae, são mundialmente disseminadas e responsáveis por um grande número de surtos. Métodos rápidos de diagnóstico proporcionam grandes benefícios clínicos e epidemiológicos. Recentemente, um método de detecção direta de KPC baseado em cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas (LC-MS/MS) foi desenvolvido. O objetivo deste trabalho foi padronizar e validar este método, com adaptações adequadas às nossas especificações e disponibilidade de equipamentos. Testamos o nosso método contra uma ampla variedade de isolados, incluindo produtores de outras carbapenemases. Para fase de validação foram selecionados 111 isolados (49 KPC-positivos e 62 KPC-negativos) provenientes de um estudo de vigilância para o monitoramento de Enterobacterales com susceptibilidade reduzida aos carbapenêmicos. Os resultados foram avaliados por um operador experiente que desconhecia a caracterização prévia dos isolados. O operador classificou corretamente 47 dos 49 isolados KPC-positivos. Todos os isolados KPC-negativos (n=62) foram corretamente classificados. O método apresentou uma sensibilidade de 96,07% e uma especificidade de 100%. A presença de outras carbapenemases não interferiu nos resultados. O peptídeo APIVLAVYTR se apresentou negativo em 19 dos 49 isolados KPC-positivos, enquanto GFLAAAVLAR apresentou apenas um resultado negativo. LTLGSALAAPQR e LALEGLGVNGQ foram detectados em todos extratos proteicos. Em conclusão, nossos resultados demonstram que os peptídeos marcadores de KPC foram robustamente detectados pelo método em LC-MS/MS, que apresentou elevada sensibilidade e especificidade e pode ser utilizado como um método confirmatório para detecção deste mecanismo de resistência em Enterobacterales.

Carbapenem-resistant Enterobacterales (CRE) have been recognized as an urgent threat to global health that cause of the majority of the difficult-to-treat infections in health-care settings and are associated with high mortality. Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) producing CREs, specially Klebsiella pneumoniae, are globally disseminated and responsible for a large number of outbreaks. Rapid methods for KPC detection provide great clinical and epidemiological benefits. Recently, a method based in liquid chromatography-tandem MS (LC-MS/MS) was developed. The aim of this study was to standardize and validate this method, with adaptations to suit our equipment availability and specifications. We tested our method against a broad variety of isolates, including other carbapenemases producers. For validation phase 111 isolates (49 KPC-positives and 62 KPC-negatives) from a surveillance study monitoring Enterobacterales with reduced susceptibility to carbapenems were selected. The results were evaluated by an expert operator blinded to the isolates previous characterization. The operator correctly classified 47 of 49 KPC-positive isolates. All KPC-negative isolates (n=62) were correctly classified. The method yields 96.07% sensitivity and 100% specificity. The presence of other carbapenemases did not interfere in the results. The APIVLAVYTR peptide was called negative in 19 from 49 KPC-positive isolates while GFLAAAVLAR presented just one negative result. LTLGSALAAPQR and LALEGLGVNGQ were detected in all protein extracts. In conclusion, our results demonstrate that the KPC peptide markers were robustly detected by the method which presented high sensitivity and specificity and therefore can be used as a confirmatory method to identify this resistance mechanism among Enterobacterales.