Investigação dos efeitos da terapia com L-carnitina em modelo animal e em pacientes portadores de acidemia glutárica do tipo I

Abstract

A acidemia glutárica tipo 1 (AG1) é uma doença hereditária do metabolismo dos aminoácidos lisina, hidroxilisina e triptofano, causada por uma deficiência da enzima glutaril-CoA desidrogenase, levando a um bloqueio nesta rota metabólica e ocasionando um acúmulo de ácidos glutárico (AG), 3-hidroxiglutárico e de seus conjugados com glicina e carnitina, especialmente a glutarilcarnitina (C5DC). O prognóstico dessa doença depende do diagnóstico precoce e instituição de um tratamento baseado suplementação L-carnitina (L-car). Vários estudos têm demonstrado o potencial antioxidante e anti-inflamatório da L-car em diversos erros inatos do metabolismo (EIM), inclusive em algumas acidemias orgânicas. Apesar disso, na AG1 esses efeitos ainda não foram avaliados. Assim, é importante que seja investigado o papel do estresse oxidativo e o perfil inflamatório na AG1 nos pacientes afetados e em modelo animal da doença, bem como estudar se o atual tratamento com L-car (100 mg/kg/dia) é capaz de proteger o organismo dos danos associados ao estresse oxidativo. Sendo assim, o presente trabalho tem por objetivo geral avaliar o dano oxidativo e os efeitos da L-car em pacientes portadores de AG1 e em modelo animal da doença, utilizando camundongos nocautes Gcdh-/-, avaliar o perfil inflamatório nos pacientes e, também, avaliar o efeito in vitro da L-car sobre o dano ao DNA induzido pelo ácido glutárico. No primeiro capítulo, foi observado um aumento significativo de AG e C5DC nos pacientes portadores de AG1, que também se mostraram deficientes em carnitina antes da suplementação. Isoprostanos (dano a lipídios), di-tirosina (dano a proteína), espécies urinárias de guaninas oxidadas (dano ao DNA) e, por último, níveis de espécies reativas do nitrogênio se mostraram significantemente aumentadas nos pacientes com a doença. Esses pacientes também apresentaram uma capacidade antioxidante reduzida. A suplementação com L-car induziu efeitos benéficos nesses processos reduzindo os níveis dos biomarcadores aumentados, bem como melhorando a capacidade antioxidante desses pacientes. O AG foi capaz de induzir o dano ao DNA in vitro em três diferentes concentrações. Testada também em três concentrações, a L-car foi capaz de prevenir in vitro esse dano, de maneira dose-dependente. Foi observado, também, um aumento nas citocinas pró-inflamatórias IL-6, IL-8, GM-CSF e TNF-α nos pacientes. Evidenciando seu papel antioxidante, a L-car foi correlacionada negativamente com os níveis de isoprostanos e positivamente com a capacidade antioxidante. No segundo capítulo, foi verificado em camundongos Gcdh-/- uma deficiência em carnitina, elevadas concentrações de C5DC e um aumento na produção de espécies reativas do oxigênio. Ainda, foi encontrado um aumento nos biomarcadores de lipoperoxidação e dano à proteínas no estriado cerebral, além de uma alteração nas enzimas antioxidantes SOD e GPx, em relação aos animais selvagens. Da mesma forma que nos pacientes, foi verificado um efeito benéfico da L-car frente a todas essas alterações em estriado cerebral neste modelo animal. Neste capítulo, DCFH (2-7-Dihidrodiclorofluoresceina) foi positivamente correlacionada com espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e negativamente com conteúdo de sulfidrilas e carnitina livre. Esta última, quantificada no sangue, foi negativamente correlacionada com C5DC. No terceiro e último capítulo desta tese, foram quantificados níveis plasmáticos de marcadores de neurodegeneração em pacientes AG1. Verificou-se que níveis do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e catepsina-D estavam significativamente aumentadas em pacientes afetados pela AG1 e tratados com L-car em relação ao grupo controle. Verificou-se, também que os níveis de C5DC estavam significativamente aumentados nos pacientes. Finalmente, a catepsina-D foi positivamente correlacionada com níveis de C5DC. Desta forma, a L-car demonstrou ser útil no tratamento da AG1, não apenas por corrigir a deficiência secundária e induzir a excreção dos metabólitos tóxicos acumulados, mas também por prevenir o dano oxidativo, tanto a nível periférico em pacientes quanto a nível central em camundongos Gcdh-/-.

Glutaric acidemia type I (GA1) is an inherited metabolic disease caused by a deficiency of the enzyme glutaryl-CoA dehydrogenase, involved in the catabolism of the amino acids lysine, hydroxylysine and tryptophan. The results is an accumulation of glutaric acid (GA), 3-hydroxyglutaric acid and its conjugated with glycine and carnitine, especially, glutarilcarnitine (C5DC). The prognosis of GA1 depends of the early diagnosis and the institution of a treatment with L-carnitine (L-car) supplementation. Several studies have demonstrated an important antioxidant and anti-inflammatory effects of L-car in some inborn errors of metabolism (IEM), including some organic acidurias. Besides that, these effects did not been evaluated in GA1. Thus, it is important to investigate the role of oxidative stress and the inflammatory profile in GA1 affected patients and in animal model of this disease, as well as to study whether the current treatment (100 mg kg−1 day−1) is able to protect the organism from damage associated with oxidative stress. Therefore, the present work has the general objective of to evaluate the oxidative damage and the effects of L-car in GA1 patients and in knockout animal model, using Gcdh-/- mouse, evaluate the inflammatory profile in these patients and also the in vitro effect of L-car on DNA damage induced by GA. In the first chapter, significant increases of GA and C5DC were observed in GA1 patients, who were also deficient in carnitine before the supplementation. Isoprostanes (lipid damage), di-tyrosine (protein damage), urinary oxidized guanine species (DNA damage) and the reactive nitrogen species were significantly increased in these patients, as well as, a reduced antioxidant capacity were observed. L-car supplementation induced beneficial effects in these processes by reducing the levels of the increased biomarkers, as well as improving the antioxidant capacity of GA1 patients. GA was able to induce DNA damage in vitro at three different concentrations. Also tested at three concentrations, L-car was able to prevent in vitro this damage in a dose-dependent manner. An increase in the pro-inflammatory cytokines IL-6, IL-8, GM-CSF and TNF-α in GA1 patients was also observed. Evidencing the antioxidant role to L-car, it was negatively correlated with the isoprostane levels and positively with the antioxidant capacity. In the second chapter it was verified that Gcdh-/- mouse present carnitine deficiency, C5DC levels elevated and an increase in reactive oxygen species production. Besides that, an increase in biomarkers of lipid peroxidation and protein damage and an alteration in the antioxidants enzymes SOD and GPx, in relation to the wild animals was observed in striatum from Gcdh-/- mouse. As found in GA1 patients, it was verified a beneficial effect of L-car against all these alterations in striatum of this GA1 animal model. In this chapter dihydrodichlorofluorescein (DCFH) was positively correlated with thiobarbituric acid-reactive substances (TBARS) and negatively with sulfhydryl content and free carnitine. This last one, quantified in the blood, was negatively correlated with C5DC. In the third and final chapter of this work, plasmatic levels of neurodegeneration markers were quantified in GA1 patients. Brain-derived Neurotrophic Factor (BDNF) and cathepsin-D were found to be significantly increased affected by GA1 patients treated with L-car in relation to the control group. It was also found that C5DC levels were significantly increased in these patients. Finally, cathepsin-D was positively correlated with C5DC levels. Thus, L-car demonstrated to be useful in GA1 treatment not only by correcting secondary deficiency and by inducing the excretion of accumulated toxic metabolites, but also for preventing oxidative damage, both at the peripheral level in GA1 patients and at the central level in Gcdh-/- mouse.