Avaliação da resposta de linhagens de glioblastoma deficientes e proficientes em AAG ao tratamento com temozolomida em combinação com agentes indutores do estresse do retículo endoplasmático

Abstract

O glioblastoma multiforme é o tumor primário adulto mais prevalente e agressivo do sistema nervoso central. Atualmente o tratamento padrão inclui: cirurgia, radioterapia e quimioterapia com Temozolomida (TMZ) adjuvante. A TMZ é um agente alquilante que danifica as bases do DNA e provoca adutos de metila especialmente nas posições N7-MeG, N3-MeA e resíduos O6-MeG na molécula do DNA. Mecanismos de reparo específicos atuam para reparar estas lesões, como a O6-MeG que é removida pela metil-guanina metil-transferase (MGMT) e as lesões N7-MeG e N3-MeA reparadas pelo reparo por excisão de bases (BER). Estas vias de reparo interferem no tratamento e, apesar de ser muito utilizado a associação de cirurgia, radioterapia e TMZ como tratamento de GBM, este tratamento não é plenamente eficiente, uma vez que após o tratamento os pacientes têm uma sobrevivência de cerca de quinze meses. Por esse motivo, tem se desenvolvido muitas pesquisas com o intuito de descobrir novas terapias afim de se aumentar a eficiência do tratamento de pacientes com GBM. A Salinomicina (SLN) é um fármaco indutor de estresse no retículo endoplasmático (RE) e recentemente seu uso tem sido explorado no tratamento de diversos tipos de tumor. O estresse no RE ativa a resposta de proteínas desenoveladas (UPR- unfolded protein response), responsável pela manutenção de um proteoma funcional, e essa resposta ativa três eixos principais para lidar com esse estresse no RE. As proteínas transmembranares residentes no RE que iniciam a UPR são: inositol-requiring enzime 1 (IRE1α), activating transcription factor 6 (ATF6) e protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase (PERK). Embora essas proteínas transdutoras sejam reguladas negativamente por chaperonas como a BiP em células saudáveis, o aumento do estresse do RE provoca a dissociação das chaperonas, induzindo assim a UPR. A alquiladenina DNA glicosilase (AAG) inicia o BER para danos induzidos por TMZ e é fundamental para as respostas celulares frente a alquilação afetando a sobrevida de pacientes com GBM. Aqui demonstramos que SLN sinergiza com o tratamento de alquilante para promover a citotoxicidade de um modo dependente de AAG. A caracterização do mecanismo molecular de suporte a essa citotoxicidade induzida de forma dependente de AAG indica que o UPR induzido pelo tratamento de TMZ e SLN envolve os eixos PERK e IRE1α. Ainda, o tratamento combinado de SLN e TMZ prejudica o fluxo autofágico em células proficientes em AAG. Em conjunto estes dados sugerem um papel para AAG no estresse do RE que poderia ser abordado para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas combinando agentes alquilantes com ativadores farmacológicos da UPR no tratamento do câncer.

Glioblastoma multiforme is the most prevalent and aggressive adult primary tumor of the central nervous system. Currently, the standart treatment includes surgery, radiotherapy and chemotherapy with adjuvant temozolomide (TMZ). TMZ is an alkylating agent that damages the DNA bases and causes methyl adducts especially in the positions N7-Meg, N3-MeA and residues O6-Meg in the DNA molecule. Specific repair mechanisms act to repair these lesions, such as the O6-Meg that is removed from the metil-guanine-metil-transferase (MGMT), and the N7-Meg and N3-MeA lesions, repaired by base excision repair (BER). These repair pathways interfere on the treatment, and even if Glioblastoma Multiforme has surgical, radiotherapic and Temozolomide chemotherapic possibilities, these arent efficient, with results showing only 15 months average survival. For this reason, many studies are exploring several mechanisms in order to increase the efficiency of treatment. Salinomycin (SLN) is a stress inducing drug of the endoplasmic reticulum (RE) and has recently been studied as therapy in the treatment of various types of cancers. The stress in the RE activates a response of the unstained protein (UPR), responsible for the maintenance of the functional proteome, and this response activates three main axis to cope with RE stress. The transmembrane proteins residing in the RE that initiate the UPR are: inositol-requiring enzime 1 (IRE1A), activating transcription factor 6 (ATF6) and protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase (PERK). Although these transductor proteins are negatively regulated by chaperones such as BiP in healthy cells, the increase in RE stress provokes the dissociation of the chaperones, thus inducing UPR. Alkyladenine DNA glycosylase (AAG) initiates base excision repair (BER) for TMZ-induced base damage and is fundamental for cellular responses to alkylation affecting the survival of glioblastoma patients. Here we show that SLN sinergize with alkylation treatment to promote an AAG dependent cytotoxity. The characterization of the molecular mechanism that suports this induced AAG dependent cytotoxicity shows that UPR induced by TMZ and SLN treament envolves PERK and IRE1 axis. Still, SLN and TMZ combined treatment hinders autophagic flow in AAG proficient cells. As a whole, these data suports a role for AAG in RE stress which could be used for the development of new therapeutic strategies which combine alkylating agents with pharmacological activators of UPR in câncer treatment.