O silenciamento da ecto-5'-nucleotidase/CD73 altera a progressão de gliomas

Abstract

O glioblastoma multiforme (GBM) é um tipo de tumor bastante agressivo, que apresenta uma elevada taxa de proliferação e um comportamento altamente invasivo. A ecto-5’-nucleotidase (e5NT/CD73) é uma enzima expressa de forma bastante ampla, a qual age na hidrólise do AMP extracelular, com consequente formação de adenosina, molécula com diversas funções celulares. Além da função enzimática, foi mostrado que a e5NT/CD73 também exerce importante papel na interação célula-célula e célula-matriz. Muitas evidências apontam para funções de promoção tumoral desempenhados pela e5NT/CD73, a qual se apresenta expressa em altos níveis em diferentes tumores. No presente estudo caracterizamos o papel desempenhado pela e5NT/CD73 no crescimento de GBM in vitro e in vivo através do silenciamento de sua expressão e atividade em células de glioma de rato C6. A e5NT/CD73 foi silenciada por RNA de interferência estável através de lentivírus e o silenciamento foi caracterizado por métodos de imunofluorescência e atividade enzimática. Além disso, investigamos parâmetros de malignidade in vitro, como adesão e migração celular. Para uma melhor análise do papel da proteína no crescimento tumoral, implantamos as células C6 silenciadas em um modelo de glioma em ratos. Análises patológicas e imunohistoquímicas usando o marcador nestina foram realizados. Foram obtidos dois clones silenciados de forma estável, C6-c54 e C6-c56, os quais tiveram uma significativa redução na expressão e atividade da e5NT/CD73. Foi observada uma significativa alteração no parâmetro de adesão in vitro de ambos clones silenciados, e esse efeito deve-se provavelmente à função de adesão exercida pela proteína e não da sua atividade enzimática, uma vez que o uso do inibidor APCP não foi capaz de diminuir a capacidade de adesão das células wt. Além disso, o implante das células silenciadas não foi capaz de gerar uma massa tumoral in vivo, o que foi confirmado posteriormente por análise imunohistoquímica. Não obstante, todos tumores C6 wt cresceram com todas características histopatológicas de GBM. O crescimento dos tumores C6 não foi bloqueado pela co-injeção com o inibidor enzimático APCP. Desse modo, nossos resultados corroboram outros dados da literatura que indicam um papel crucial da sinalização purinérgica na progressão de GBM. Estudos complementares são necessários para o estabelecimento de novas e mais eficazes terapias contra esses tumores, utilizando a e5NT/CD73 como alvo.

Glioblastoma (GBM) is a very aggressive tumor that presents a high proliferative and invasive behavior. Ecto-5’-nucleotidase (e5NT/CD73) is a widely expressed enzyme that hydrolyses extracellular AMP, producing adenosine, an important molecule in several cell functions. Besides that, e5NT/CD73 has been shown to exert an important role in cell-cell and cell-matrix interactions. Several evidences suggest that e5NT/CD73 has tumor-promotion functions, being upregulated in several tumors. In this study we aimed to better characterize the role of e5NT/CD73 in glioma progression by silencing its expression in a rat C6 glioma cells and analyzing the in vitro and in vivo growth of GBM. Knockdown (KD) of e5NT/CD73 was obtained through stable RNA interference mediated by lentivirus and KD cells were analyzed through immunofluorescence and activity methods such as HPLC and malaquite-green. We also assessed parameters of malignancy in vitro, such as cell adhesion and migration. For a deeper investigation, we implanted KD C6 cells in rat striatum and performed pathological and immunohistochemical analyses to assess tumor size and malignancy. Two stable e5NT/CD73 KD clones of C6 glioma cells were obtained, named C6-c54 and C6- c56, and these clones presented a large reduction in expression and AMPase activity of e5NT/CD73. A significant alteration in adhesion parameter of silenced cells was observed in vitro possibly due to the loss of the adherence function of e5NT/CD73 per se. In addition, e5NT/CD73 KD cells were not able to develop a tumor mass in the striatum of rats, which was confirmed by immunohistochemistry analyses, whereas all rats injected with C6 wt cells developed tumors with all histopathological features of GBM. Tumor growth of C6 wt cells was not blocked by the co-injection with the enzymatic inhibitor APCP. Taken together these results reinforce the crucial involvement of purinergic signaling in the GBM progression. Further studies are necessary to establish new and powerful therapies against these tumors using e5NT/CD73 as target.