Investigação do dano oxidativo em pacientes portadores de deficiências da beta-oxidação mitocondrial de ácidos graxos e do efeito in vitro dos metabólitos acumulados e da L-carnitina sobre o dano ao DNA

Abstract

As deficiências na beta-oxidação mitocondrial de ácidos graxos são Erros Inatos do Metabolismo (EIM), doenças genéticas raras que se caracterizam pelo acúmulo de ácidos graxos de cadeia de diferentes tamanhos, conforme a enzima afetada, em fluidos e tecidos corporais. Elas são ocasionadas por vários tipos de mutações, que comprometem a codificação adequada das enzimas desidrogenases envolvidas na oxidação mitocondrial dos ácidos graxos para serem utilizados como fonte energética alternativa durante o jejum. Embora os mecanismos fisiopatológicos dessas doenças ainda não estejam completamente esclarecidos, estudos mostram que o acúmulo de metabólitos tóxicos pode estar relacionado. Considerando estudos realizados em modelos animais e em outros EIM que demonstraram que os metabólitos tóxicos podem alterar os parâmetros de estresse oxidativo, os objetivos deste trabalho foram avaliar a lipoperoxidação através da medida de 8-isoprostanos, avaliar o dano oxidativo ao DNA e ao RNA através da medida de espécies oxidadas de guanina e avaliar parâmetros de estresse nitrosativo através da medida do conteúdo de nitritos e nitratos em amostras de urina de pacientes portadores da deficiência da desidrogenase de 3-hidroxi-acil-CoA de cadeia longa (LCHADD), da deficiência da desidrogenase de acil-CoA de cadeia média (MCADD) e da deficiência da desidrogenase múltipla de acil-CoA (MADD). Além disso, foi também objetivo analisar o dano ao DNA in vitro induzido pelos metabólitos ácido subérico, ácido adípico, hexanoilglicina, suberilglicina, isoladamente e conjuntamente, bem como o efeito da co-incubação com o antioxidante L-carnitina, através no ensaio cometa em leucócitos humanos. Foi observado um aumento significativo dos níveis de 8-isoprostanos na urina de todos os grupos de pacientes comparado à urina do 2 grupo controle, indicando lipoperoxidação. Os níveis de nitritos e nitratos estavam significativamente aumentados apenas na urina de pacientes portadores da LCHADD, sugerindo estresse nitrosativo nesse grupo de pacientes em comparação ao grupo controle. A análise de 8-hidroxi-2-deoxiguanosina revelou aumento significativo dos níveis deste biomarcador na urina de pacientes com LCHADD e MADD, sugerindo dano oxidativo ao DNA nesses grupos de pacientes em comparação ao grupo controle. Na avaliação in vitro, foi identificado aumento significativo no índice de dano ao DNA induzido por todos os metabólitos estudados, isoladamente e conjuntamente, sendo que a incubação conjunta apresentou um efeito danoso potencializado. A L-carnitina foi capaz de diminuir significativamente o índice de dano ao DNA induzido por todos os metabólitos, exceto pelo ácido subérico. Esses resultados demonstram que o acúmulo de metabólitos tóxicos pode estar relacionado aos parâmetros de estresse oxidativos e nitrosativo aumentados na urina de pacientes com deficiência na beta-oxidação mitocondrial de ácidos graxos, e que os metabólitos ácido adípico, ácido subérico, hexanoilglicina, suberilglicina, isolados ou em conjunto, causam dano ao DNA, que foi revertido pela L-carnitina, conferindo proteção oxidante.

The mitochondrial fatty acids oxidation disorders (FAOD) are Inborn Errors of Metabolism (IEM) which are rare genetic diseases characterized by the accumulation of fatty acids of different sizes of chain according to the affected enzyme in tissue and body fluids. They are caused by several types of mutations that compromise the correct encoding of the dehydrogenase enzymes evolved on the fatty acids mitochondrial oxidation in order to be utilized as an alternative source of energy during fasting. Although the pathophysiological mechanisms underlying these disorders are still not completely understood, studies have demonstrated that the accumulation of toxic metabolites may be related. Considering previous studies in animal models and in others IEM that verified that toxic metabolites may alter the oxidative stress parameters, the aims of this study were to evaluate the lipid peroxidation by the measurement of 8-isoprostanes, to evaluate DNA and RNA oxidative damage by the measurement of oxidized guanine species and to evaluate nitrosative stress parameters by the measurement of nitrite and nitrate content in urine samples of long-chain 3-hydroxyacyl CoA dehydrogenase deficiency (LCHADD), medium-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency (MCADD) and multiple acyl-CoA dehydrogenase deficiency (MADD) patients. Moreover, it was also an objective to evaluate the in vitro DNA damage of the metabolites adipic acid, suberic acid, hexanoylglycine and suberylglycine, separated and together, and the effect of L-carnitine by the comet assay in human leukocytes. It was observed a significant increase on 8-isoprostanes levels in urine of all groups of patients compared to the control group, indicating lipoperoxidation. The nitrite and nitrate levels were significantly increased only in urine of LCHADD patients, suggesting 4 nitrosative stress in this group of patients compared to the control group. The analysis of DNA and RNA damage revealed significant increase on 8-hydroxy-2-deoxyguanosine levels in urine of LCHADD and MADD patients, suggesting oxidative damage in these groups of patients compared to the control group. In the in vitro evaluation, we identified a significant increase of the DNA damage index induced by all metabolites, separated and together, and the incubation with all metabolites together resulted in a potencialyzed effect. L-carnitine was capable of decrease significantly the DNA damage index induced by all metabolites, except by suberic acid. These results demonstrate that the accumulation of toxic metabolites may be related to the increased oxidative and nitrosative stress parameters in urine of patients with the fatty acids oxidation disorders and that the metabolites adipic acid, suberic acid, hexanoylglycine and suberylglycine, separated and together, cause DNA damage, which was reduced significantly by L-carnitine, demonstrating antioxidant protection.