Descelularização e recelularização de fígados para engenharia de tecidos e medicina regenerativa

Abstract

Introdução: O único tratamento definitivo para a falência hepática é o transplante, porém existe um déficit muito grande entre o número de órgãos doados e a demanda de pacientes necessitando-os. Em tal contexto, a engenharia de tecidos propõe-se a produzir alternativas viáveis para sanar esse déficit. Uma técnica que vem ganhando destaque é a da descelularização e recelularização de órgãos. Essa técnica cria um scaffold natural e acelular e com as características do órgão utilizado, ideal para ser repovoado por células. As células-tronco mesenquimais são uma ótima opção para o repovoamento do órgão, pois apresentam a capacidade de se diferenciar em hepatócitos e tem uma capacidade replicativa alta. Objetivos: Descelularizar e recelularizar, com células-tronco mesenquimais isoladas de tecido pulpar de dente decíduo humano, a matriz extracelular de fígados proveniente de ratos, utilizando-se um biorreator produzido no laboratório. Métodos: Um biorreator de perfusão foi desenvolvido para utilização nos procedimentos de descelularização e recelularização do fígado. A descelularização dos fígados foi realizada pela a perfusão de uma solução de 0,5% de SDS. A esterilização do scaffold foi realizado com uma solução de ácido peracético 0,1% em etanol 4% durante 3h. A matriz foi lavada com PBS com antimicrobianos. A recelularização foi realizada com 108 células-tronco mesenquimais isoladas de dente decíduo as quais foram cultivadas durante 7 dias. Foram realizadas análises funcionais e estruturais nas matrizes descelularizadas e recelularizadas. Foram utilizados 4 fígados descelularizados e 5 fígados recelularizados para as análises. Resultados: As matrizes descelularizadas mostraram ausência de DNA com preservação do colágeno e dos GAGs, confirmando a eficiência do processo. A recelularização apresentou uma eficiência de retenção de 97% das células inseridas. As análises funcionais mostram que as células continuaram produzindo albumina e ureia na mesma quantidade que as células cultivadas em placa de cultura. Ocorreu um aumento do LDH nos primeiros dias de cultivo, sugerindo que as células morrem nos primeiros dias após a recelularização, mas estabilizam-se aos 7 dias de cultivo. A análise histológica mostrou conservação da trama de colágeno e algumas células agrupadas próximas aos vasos. Conclusão: Foi possível a construção e a utilização de um biorreator no laboratório para descelularizar e recelularizar com sucesso fígados de ratos com células-tronco mesenquimais, as quais mantiveram-se vivas e metabolicamente ativas durante 7 dias de cultivo. Apesar de as células, não terem sido capazes de se diferenciar em hepatócitos, durante o período estudo, sem nenhum estimulo químico, a recelularização dos fígados de ratos foi efetivada, criando uma nova via de pesquisa no laboratório para a construção de órgãos in vitro.

Introduction: Orthotopic liver transplantation is the only definitive treatment for hepatic failure, but there is a great deficit between the total number of donated organs and the patients in need of them. In such a context, tissue engineering presents itself for producing viable alternatives to eliminate this deficit. One technique gaining the spotlight is organ decellularization and recellularization of organs. This technique creates a natural and acellular scaffold maintaining the native characteristics of the utilized organ, which makes it ideal for the reseeding of cells. Mesenchymal stem cells are a great option for the reseeding of organs as they have the capacity of differentiating into hepatocytes and have a high proliferative rate. Aims: Using mesenchymal stem cells isolated from deciduous teeth, decellularize and recellularize the extracellular matrix from rat livers using a perfusion bioreactor constructed in the laboratory. Methods: The perfusion biorreator was made to use in the process of liver decellularization and recellularization. The liver decellularization was made with a 0.5% solution of SDS. The sterilization of the scaffold was made with a 0.1% solution of peracetic acid in 4% ethanol for 3 hours. The matrix was washed in PBS with antibiotics. The recellularization was made with 108 mesenchymal stem cells isolated from deciduous teeth pulp and cultivated for 7 days. Functional and structural analyses were made in both matrixes. Four decellularized livers and five recellularized livers were used for the analyses. Results: The decellularized matrixes showed an absence of DNA while preserving the qualities of the collagen and the GAGs, thus confirming the efficiency of the process. The recellularization was carried with the retention of 97% of the inserted cells. The functional analyses showed that the cells continued to produce albumin and urea at the same levels as the cells cultivated in the culture plates. A rise in LDH levels occurred in the first days of the culture, suggesting that there is cell death in the first days after recellularization, but they stabilized on the 7th day. Histological analysis showed conservation of the collagen web and some groups of cells next to the vessels. Conclusion: The construction and use of a bioreactor in the laboratory to decellularize and recellularize the rat livers with mesenchymal stem cells was successful. They were able to survive and be metabolically active during the 7 days in culture. Even though the cells were not able to differentiate into hepatocytes during the time of the study without any chemical stimulus, the liver recellularization was carried out with success, creating a new line of research in the laboratory to produce organs in vitro.