Caracterização de um modelo de inflamação em larvas de zebrafish : o papel do sistema purinérgico

Abstract

Introdução: Entre os modelos utilizados para o estudo da inflamação está o que utiliza o cobre como agente inflamatório. O sistema purinérgico está envolvido na inflamação e em alguns tecidos pode ser afetado pela ação do cobre. Não obstante, nada se sabe sobre o comportamento do sistema purinérgico frente à inflamação induzida por este metal em larvas de zebrafish. Objetivo: Estabelecer e caracterizar um modelo de inflamação induzida pelo cobre em larvas de zebrafish e elucidar o envolvimento do sistema purinérgico. Métodos: Desenvolvemos uma metodologia para a quantificação de óxido nítrico (NO) por cromatografia líquida para a avaliação inicial dos efeitos do cobre sobre o estresse oxidativo. Posteriormente, realizamos curvas de mortalidade para o cobre e o lipopolissacarídeo (LPS) de Escherichia coli (E.coli). A metodologia foi utilizada para avaliar os níveis de NO após a indução da inflamação pelo cobre e a comparação com o outro agente inflamatório, bem como para quantificar os níveis basais desse íon em larvas de diferentes dias pós-fertilização. Na seguinte etapa, inserimos outros marcadores de estresse oxidativo e testamos as concentrações de 1, 10 e 25 µM de cobre durante um período de vinte e quatro horas. A concentração de 10 µM foi utilizada para indução da inflamação e a caracterização do sistema purinérgico. Os parâmetros avaliados foram estresse oxidativo, migração de neutrófilos, prostalandina E2 (PGE2), expressão gênica de mediadores inflamatórios, hidrólise extracelular de ATP e atividade das ecto-nucleotidases e da adenosina deaminase (ADA). As expressões gênicas das enzimas e dos receptores também foram avaliadas, bem como a absorção de cobre durante o período de exposição. Resultados: Por conseguinte, a metodologia utilizada para a determinação de NO foi validada com êxito e considerada adequada para a determinação do analito em alterações fisiológicas e patológicas em larvas de zebrafish. As curvas de mortalidade mostraram que as concentrações subletais foram de 10 µM para o cobre e 150 µg/ml para o LPS. As concentrações de NO em larvas de diferentes dias pós-fertilização apresentaram níveis crescentes de acordo com o estágio de desenvolvimento, ao passo que a exposição ao cobre e ao LPS induziram ao aumento do NO em comparação ao grupo controle nos tempos testados. Posteriormente, foi constatado que após a exposição ao cobre, ocorreu uma série de eventos inflamatórios que envolveram a PGE2 e a migração de neutrófilos para o foco inflamatório. A absorção do cobre foi tempo-dependente e coincidiu com o aumento do estresse oxidativo. As atividades da ecto-5´-nucleotidase (Ecto-5´-NT) e da ADA apresentaram redução, sendo que a nível molecular também foram constatadas alterações nas expressões gênicas destas enzimas. Os receptores de adenosina apresentaram aumento das suas expressões gênicas. Conclusão: O acúmulo do cobre absorvido durante o período de 24 horas induziu a inflamação e o estresse oxidativo. Dentro do sistema purinérgico o mais envolvido foi o adenosinérgico, que parece estar envolvido principalmente na resolução da inflamação. Esses resultados trazem novos avanços na caracterização da resposta inflamatória induzida pelo cobre em larvas de zebrafish, fornecendo novos conhecimentos e ferramentas para o estudo de mecanismos de ação e para a triagem de efeitos de novas terapias anti-inflamatórias.

Introduction: Inflammation induced by copper exposure has been recently characterized in zebrafish. The purinergic system is closely involved in inflammation, although there is no available study correlating this system and the inflammatory effects of copper. Objective: The present study was aimed to characterize a model of inflammation induced by copper in zebrafish larvae, with special attempts to elucidate the involvement of the purinergic system in this condition. Methods: Firstly, we developed a methodology for the measurement of nitric oxide (NO) by liquid chromatography, for the initial evaluation of the effects of copper on oxidative stress. Subsequently, we carried out mortality curves for exposition to copper and lipopolysaccharide (LPS) from Escherichia coli (E. coli). NO was quantified in both inflammatory models, and in larvae at different days post-fertilization. Additional markers of oxidative stress were quantified, and the concentrations of 1, 10 and 25 µM of copper were evaluated during 24 h of treatment. The concentration of 10 µM of copper was used for induction of inflammation and to characterize the relevance of purinergic system in this context. The parameters assessed were: oxidative stress, neutrophil migration, prostaglandin E2 (PGE2), expression of inflammatory cytokines, extracellular ATP hydrolysis and ecto-nucleotidases and adenosine deaminase (ADA) activities. The gene expression of enzymes and receptors related to the purinergic system were evaluated. The absorption of copper during the exposure period was also measured. Results: The methodology for the determination of NO was successfully validated and considered suitable to assess the physiological and the pathological changes of NO levels in zebrafish larvae. The mortality curves showed that sub-lethal concentrations were 10 µM and 150 µg/ml for copper and LPS, respectively. The concentrations of NO in zebrafish larvae at different days post-fertilization showed increased levels according to the stage of development. The exposure to copper and LPS induced a significant increase in NO levels. After copper exposure, there was an increase of PGE2 levels and migration of neutrophils to the inflammatory focus. The absorption of copper was time-dependent and coincides with increased oxidative stress. The activities of ecto-5'-nucleotidase (Ecto-5'-NT) and ADA decreased, and at the molecular level, it was possible to detect changes in expression of genes related to these enzymes. Relevantly, the mRNA expression of adenosine receptors was found augmented. Conclusion: The increase in copper concentrations in zebrafish larvae correlated well with the evolution of inflammation and oxidative stress in the zebrafish larvae. Within the purinergic system, the adenosinergic mechanisms appear to be mainly involved in the resolution of inflammation. Our results provide new advances on the characterization of inflammatory response induced by copper in zebrafish larvae, providing new knowledge and tools for the study of mechanisms of action and screening effects of new anti-inflammatory therapies.