Avaliação e validação da utilidade clínica do sequenciamento de nova geração (NGS) para confirmação do diagnóstico de doenças lisossômicas selecionadas

Abstract

Introdução: As doenças lisossômicas (DLs) são patologias genéticas que, apesar de serem classificadas como raras, acometem uma significativa porcentagem da população. Muitos fatores tornam seu diagnóstico desafiador, entre eles a variabilidade no fenótipo, com poucos sinais e sintomas clínicos específicos. O desenvolvimento de ferramentas inovadoras de investigação, destacando-se os novos métodos de sequenciamento massivo, reduziria a “odisseia diagnóstica” enfrentada pelo paciente e sua família, proporcionaria um diagnóstico mais precoce com melhor resultado no tratamento nas situações em que há terapia disponível, além de um adequado aconselhamento genético. A tecnologia de sequenciamento de nova geração (next-generation sequencing, NGS) tem claras vantagens sobre as técnicas de sequenciamento convencional, oferecendo um alto rendimento diagnóstico ao permitir definir um espectro mutacional abrangente. O NGS permite o sequenciamento de vários genes simultaneamente com custo global relativamente baixo, tornando painéis de genes uma alternativa atrativa para o screening genético. Esta abordagem é capaz de detectar, de maneira altamente específica, variantes missense, nonsense, de sítio de splicing, e pequenas indels, e algumas grandes deleções em homozigose ou hemizigose. No entanto, para que essa tecnologia seja aplicável à prática clínica, é necessária uma etapa de validação prévia para a determinação dos parâmetros críticos de análise desde o processamento da amostra até a análise e interpretação de dados. Após a validação dos métodos, será possível a avaliação da utilidade clínica de painéis NGS para diversas aplicações, incluindo seu uso como método confirmatório nos casos de triagem neonatal alterada para doenças lisossômicas. Objetivos: 1) Desenhar e validar uma estratégia baseada no NGS para a análise de 24 genes, incluídos em 3 painéis distintos de acordo com parâmetros pré definidos, e associados com 22 DLs; 2) Avaliar a qualidade e eficiência do ADN extraído de sangue impregnado em papel filtro (SIPF) para uso no NGS; 3) Avaliar a utilidade clínica do NGS para: a) diagnóstico molecular, b) diagnóstico diferencial e, c) confirmação diagnóstica de casos alterados na triagem neonatal para pelo menos 4 dessas condições (doença de Gaucher, Fabry, Pompe e Niemann-Pick tipo A/B). Metodologia: Estudo descritivo, amostragem por conveniência, incluindo pacientes com diagnóstico clínico e bioquímico das DLs estudadas. Foi utilizada a plataforma NGS Ion Torrent Personal Genome Machine (Thermo Fisher Scientific) para sequenciamento de três painéis de genes, desenhados através da ferramenta Ion AmpliseqTM Designer (Thermo Fisher Scientific). Para a validação foram incluídos pacientes com diagnóstico molecular prévio por sequenciamento de Sanger. Para a extração de ADN de SIPF, foi avaliado o método não comercial de fenol-clorofórmio. A utilidade clínica do NGS foi estabelecida através do: a) diagnóstico molecular de um grupo de pacientes com suspeita de lipofuscinose ceróide neuronal tipo 2 (CLN2) para o estabelecimento do genótipo (TPP1) associado à doença, assim como estabeleceu-se o diagnóstico molecular de outros pacientes com suspeita clínica e/ou bioquímica de algumas das DLs selecionadas, b) diagnóstico diferencial de um paciente utilizando um dos painéis NGS desenhados e, c) avaliação das amostras de recém-nascidos (obtidas em estudo paralelo) que tiveram resultados inicialmente alterados na triagem neonatal bioquímica para algumas das DLs selecionadas. Resultados: 1) Três painéis foram desenhados, cada um consistindo em dois pools de primers que amplificam as regiões codificantes e 20pb da junção exon-intron. Os painéis A, B e C têm amplitude de cobertura de 97.74, 99.6 e 98.38%, respectivamente. Nesta validação foi possível estabelecer a sensibilidade, especificidade e limitações de cada painel (Artigo 1); 2) foi estabelecida a metodologia para a extração de ADN para seu uso em vários processos moleculares downstream: PCR convencional, Real-Time PCR, PCR-RFLP, MLPA, Sequenciamento de Sanger e NGS na plataforma Ion Torrent PGMTM (Artigo 2); 3) A utilidade clínica dos painéis desenhados foi estabelecida através de: a) Genotipagem de 48 pacientes com suspeita clínica e bioquímica de CLN2 (painel C) (Artigo 4), e de 3 outros casos: 1 caso de Niemann-Pick tipo B (SMPD1) (painel B) e 2 casos de doença de Danon (LAMP2) (painel A) (Artigo 1), b) o diagnóstico diferencial foi realizado através do caso de um paciente com suspeita inicial de Niemann-Pick C que, após a análise molecular, foi diagnosticado com Niemann-Pick tipo B utilizando o painel B, (Artigo 1) c) a aplicabilidade dos painéis de genes para a confirmação diagnóstica em casos de triagem neonatal foi realizada em 2 casos com resultados alterados na triagem neonatal: um caso de Pompe (painel A) e outro de Gaucher (painel B) (Artigo 3 e Anexo I). Conclusão: A abordagem por NGS através do uso de painéis, foi capaz de identificar diferentes alterações genéticas nos genes estudados, incluindo variantes do tipo missense, nonsense, de sítio de splicing, e pequenas indels. Estes painéis oferecem uma estratégia de triagem dos 24 genes associadas às DLs selecionadas. Este trabalho foi inovador ao utilizar o NGS para a análise molecular dos genes associados às DLs no Brasil; foi desenvolvido no Laboratório de Genética e Biologia Molecular do Serviço de Genética Médica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, conhecido como um centro de referência em diagnóstico e pesquisa de DLs, e que atualmente tem os painéis NGS como principal ferramenta de diagnóstico molecular.

Introduction: Lysosomal diseases (LDs) are genetic pathologies that, although classified as rare, affect a significant percentage of the population. Many factors make its diagnosis challenging, including variability in phenotype, with few specific clinical signs and symptoms. The development of innovative research tools, highlighting new methods of massive sequencing, would reduce the "diagnostic odyssey" faced by the patient and his family, would provide an earlier diagnosis with better treatment outcome in situations where therapy is available, in addition to adequate genetic counseling. Next-generation sequencing (NGS) technology has clear advantages over conventional sequencing techniques, offering a high diagnostic yield by enabling a comprehensive mutational spectrum to be defined. The NGS allows the sequencing of several genes simultaneously with relatively low overall cost, making gene panels an attractive alternative for genetic screening. This approach is able to detect, in a highly specific manner, missense, nonsense, splicing, and small indels variants, and some large deletions in homozygosis or hemizygosis. However, for this technology to be applicable to clinical practice, a prior validation step is required to determine the critical parameters of analysis from sample processing to data analysis and interpretation. After validation of the methods, it will be possible to evaluate the clinical usefulness of NGS panels for several applications, including their use as a confirmatory method in cases of altered neonatal screening for lysosomal diseases. Objectives: 1) To design and validate an NGS-based strategy for the analysis of 24 genes, included in 3 different panels according to pre-defined parameters, and associated with 22 LDs; 2) To evaluate the quality and efficiency of DNA extracted from dried blood spots (DBS) for its use in NGS; 3) To evaluate the clinical use of NGS for: a) molecular diagnosis, b) differential diagnosis and c) diagnostic confirmation of altered cases in neonatal screening for at least 4 of these conditions (Gaucher, Fabry, Pompe and Niemann-Pick type A / B). Methodology: Descriptive study, convenience sampling, including patients with clinical and biochemical diagnosis of selected LDs. The NGS Ion Torrent Personal Genome Machine (Thermo Fisher Scientific) platform was used for the sequencing of three gene panels, designed using the Ion Ampliseq ™ Designer tool (Thermo Fisher Scientific). For the validation, patients with previous molecular diagnosis by Sanger sequencing were included. For the extraction of DBS DNA, a non-commercial method of phenol-chloroform was evaluated. The clinical utility of NGS was established through: a) molecular diagnosis of a group of patients with suspected type 2 neuronal cercoid lipofuscinosis (CLN2) to establish the disease-associated genotype (TPP1), as well as the molecular diagnosis of other patients with clinical and / or biochemical suspicion of some of the selected LDs, b) differential diagnosis of a patient using one of the designed NGS panels, and c) evaluation of the newborn samples (obtained in a parallel study) that initially had altered results in the neonatal screening for some of the selected LDs. Results: 1) Three panels were designed, each consisting of two pools of primers that amplify the coding regions and 20pb of the exon-intron junction. Panels A, B and C have coverage range of 97.74, 99.6 and 98.38%, respectively. In this validation it was possible to establish the sensitivity, specificity and limitations of each panel (Article 1); 2) the methodology for the extraction of DNA for its use in several downstream molecular processes was established: conventional PCR, Real-Time PCR, PCR-RFLP, MLPA, Sanger Sequencing and NGS in the Ion Torrent PGMTM platform; 3) The clinical use of the panels was established through: a) Genotyping of 48 patients with clinical and biochemical CLN2 (panel C) (Article 4), and of 3 other cases: 1 case of Niemann-Pick type B ( SMPD1) (panel B) and 2 cases of Danon's disease (LAMP2) (panel A) (Article 1), b) he differential diagnosis was made through the case of a patient with initial suspicion of Niemann-Pick C who, after molecular analysis, was diagnosed with Niemann-Pick type B using panel B (Article 1), c) the applicability of the gene panels for diagnostic confirmation in cases of neonatal screening was performed in 2 cases with altered results in neonatal screening: one case of Pompe (panel A) and another case of Gaucher (panel B) (Article 3 and Annex I) . Conclusion: The NGS approach using gene panels was able to identify different genetic alterations in the genes studied, including missense, nonsense, splicing variants, and small indels. These panels offer a screening strategy for the 24 genes associated with the selected LDs. This work was innovative by using NGS for the molecular analysis of genes associated with LDs in Brazil; it was developed in the Laboratory of Genetics and Molecular Biology of the Medical Genetics Service of the Hospital de Clinicas de Porto Alegre, known as a reference center in diagnosis and research of LDs, and that currently has the NGS panels as the main tool of molecular diagnosis.