Avaliação de possível efeito adverso do canabidiol e derivados sintéticos durante e após o desenvolvimento neuronal : envolvimento do sistema endocanabinoide

Abstract

A via de sinalização retrógrada endocanabinoide é ubíqua no sistema nervoso central (SNC), onde modula as sinapses, entre outros processos. Os componentes do sistema endocanabinoide (SEC) - receptores canabinoides, endocanabinoides e enzimas de síntese/degradação - são expressos e funcionais desde os estágios iniciais de desenvolvimento embrionário até o final do desenvolvimento cortical na adolescência, regulando o destino das células progenitoras, a diferenciação neural, sua migração e sobrevivência. Esses fatores podem conferir maior vulnerabilidade aos efeitos adversos da exposição precoce aos canabinoides. O canabidiol (CBD) é um dos fitocanabinoides exógenos mais estudados, e tem sido usado no tratamento de crianças com epilepsia refratária. No entanto, não há evidências suficientes sobre potenciais consequências prejudiciais dos canabinoides a longo prazo no desenvolvimento do SNC. O CBD é capaz de atuar direta e indiretamente no SEC, podendo perturbar processos regulatórios mediados por este sistema. Nos últimos anos, análogos sintéticos do CBD foram desenvolvidos visando aumentar seus efeitos benéficos, mas reduzindo os efeitos colaterais. Neste estudo avaliamos os efeitos neuroprotetores/neurotóxicos e anticonvulsivantes do CBD e de alguns de seus derivados sintéticos durante e após fases do desenvolvimento neuronal, verificando o papel do SEC nesses efeitos. Para isso, foi utilizado um modelo animal com maior susceptibilidade a crises epilépticas, tratados com 10 mg/kg de CBD com 15 e 44 dias de vida e submetidos a crises epilépticas induzidas por ácido kaínico (KA). Neste modelo, o CBD foi capaz de aumentar os níveis hipocampais de endocanabinoides, associado a um aumento da susceptibilidade a crises epilépticas em animais de 15 dias. Animais com 44 dias não tiveram alterações nos níveis de endocanabinoides e apresentaram uma discreta redução na susceptibilidade a crises epilépticas após a administração de CBD. Esses resultados reforçam a hipótese de que o aumento da ativação endocanabinoide seria um dos mecanismos de ação do CBD. Para as análises in vitro, utilizamos células da linhagem de neuroblastoma humano SH-SY5Y diferenciadas em neurônio maduro – como um modelo de toxicidade em neurônios terminalmente diferenciados –, e durante a diferenciação – como um modelo de toxicidade durante o desenvolvimento neuronal. Nestes modelos, foi possível verificar efeitos neurotóxicos do CBD e de 3 de seus derivados sintéticos com ou sem o desafio com a neurotoxina redox-ativa 6-OHDA durante a diferenciação neuronal. Além disto, o cotratamento destas células com cada canabinoide e com um agonista e um antagonista de CB1, aumentou e reduziu, respectivamente, a viabilidade celular observada para cada canabinoide, evidenciando uma participação do sistema endocanabinoide nos efeitos observados. In vitro, todos os derivados sintéticos apresentaram neurotoxicidade em 2,5 μM. Os efeitos neurotóxicos observados podem ser atribuídos a um possível desequilíbrio redox causado em células tratadas durante a diferenciação com canabinoides tanto isoladamente quanto em desafios com a 6-OHDA. No entanto, como os co-tratamentos com agonista e antagonista CB1 interferiram nestes resultados, é provável que o SEC esteja envolvido nos mecanismos de neuroproteção/neurotoxicidade observados. Além disso, a afinidade destes canabinoides por CB1 predita in silico sugere que pode haver interação direta nas concentrações testadas. Os resultados obtidos nos modelos in vivo e in vitro corroboram entre si, pois animais neonatos e neurônios em diferenciação foram mais sensíveis aos canabinoides e reforçam a hipótese d o uso de canabinoides em indivíduos muito jovens, com cérebros imaturos, deve ser melhor avaliado.

The endocannabinoid retrograde signaling pathway is ubiquitous in the central nervous system (CNS), where it modulates synapses, among other processes. The components of the endocannabinoid system (ECS) - cannabinoid receptors, endocannabinoids and its synthesis / degradation enzymes - are expressed and functional from the early stages of embryonic development until the end of cortical development in adolescence, regulating progenitor cells’ fate, neural differentiation, their migration and survival. These factors may confer greater vulnerability to the adverse effects of early exposure to cannabinoids. Cannabidiol (CBD) is one of the most widely studied exogenous phytocannabinoid and has been used in the treatment of children with refractory epilepsy. However, there is insufficient evidence on the potential long-term harmful effects of cannabinoids on CNS development. CBD is able to act directly and indirectly over the ECS and may disturb regulatory processes mediated by this system. In recent years, synthetic analogues of CBD have been developed to increase their beneficial outcomes but reduce side effects. In this study we evaluated the neuroprotective / neurotoxic and anticonvulsive effects of CBD and some of its synthetic derivatives during and after phases of neuronal development, verifying the role of the ECS in these effects. For this, an animal model with increased susceptibility to seizures, treated with 10 mg / kg of CBD at 15 and 44 days of life and submitted to kainic acid (KA)-induced seizures, was used. In this model, CBD was able to increase hippocampal levels of endocannabinoids, associated with increased susceptibility to epileptic seizures in animals of 15 days. Animals with 44 days had no alterations in endocannabinoid levels and presented a slight reduction in susceptibility to epileptic seizures after CBD administration. These results reinforce the hypothesis that increased endocannabinoid activation would be one of the mechanisms of action of CBD. For the in vitro analyzes, the human neuroblastoma SH-SY5Y cell line was used after differentiation into mature neurons - as a terminally differentiated neuronal toxicity model - and during differentiation - as a neuronal developmental toxicity model. In these models, it was possible to verify neurotoxic effects of CBD and of 3 of its synthetic derivatives with or without the challenge with the redox-active 6-OHDA neurotoxin during neuronal differentiation. In addition, the co-treatment of these cells with each cannabinoid and with an agonist and a CB1 antagonist, respectively, increased and reduced the cellular viability observed for each cannabinoid, evidencing a participation of the endocannabinoid system in the observed effects. In vitro, all synthetic derivatives showed neurotoxicity in 2.5 μM. The observed neurotoxic effects can be attributed to a possible redox imbalance caused in cells treated during differentiation with cannabinoids both alone and in challenges with 6-OHDA. However, as co-treatments with the CB1 agonist and antagonist alter these results, it is likely that ECS is involved in the neuroprotection / neurotoxicity mechanisms observed. In addition, both the effects of cannabinoids and the participation of ECS in these effects appear to be dose dependent and age related. Furthermore, the affinity of cannabinoids for CB1 predicted in silico suggests that there may be direct interaction between them at the concentrations tested. The results obtained in the in vivo and in vitro models corroborate to each other, since neonates and neurons treated during differentiation were more sensitive to cannabinoids and reinforce the hypothesis that the use of cannabinoids in very young individuals with immature brains should be better evaluated.