Analysis of SOX2 expression in Potential Malignant lesions and oral squamous cell carcinoma and the role of KLK6-SOX2 gene regulatory network during EMT

Abstract

O fator de transcrição SOX2 regula a identidade celular em células embrionárias efacilita a reprogramação das células somáticas terminalmente diferenciadas para umestado de células-tronco pluripotente. A diminuição na expressão deSOX2 é um indicativo de pior prognóstico e baixa sobrevida de pacientes com câncer. Nossa hipótese é a de que, durante o processo de carcinogênese do carcinoma oral de células escamosas (OSCC) ocorre uma desregulação negativa na expressão de SOX2, contribuindo para o comportamento invasivo das células tumorais na matriz extracelular. Nós analisamos a expressão de SOX2 em biópsias humanas de carcinoma oral e lesões potencialmente malignas (PMOL). Foram utilizadas biópsias da mucosa oral (livre de lesão, n = 13), hiperplasia (n = 6) e displasias (n = 21), carcinomas orais com elevado (n = 12) ou baixo grau de malignidade (n = 12), os quais foram submetidos à análise de expressão de SOX2 por hibridização in situ fluorescente (FISH) e imuno-histoquímica para SOX2 e Vimentina, um marcador de células mesenquimais. Observou-se um aumento na expressão de SOX2 em regiões de proliferação em PMOLe no centro do tumor, mas nas zonas de invasão onde as células passam pelo processo de transição epiteliomesênquima (EMT), SOX2 apresentou diminuição da expressão. Em seguida, analisamos o possível papel da SOX2 no EMT.Utilizou-se a linhagem celular FaDu, de tumor de cabeça e pescoço (HNSCC) e clones geneticamente modificados, nos quais a expressão da peptidase relacionados com calicreína 6 (FaDu-shKLK6) foi silenciada empregando short hairpinRNAs (shRNA). KLK6 pertence a uma família de 15 serino-proteases secretadas, que altera marcadores de EMT e um silenciamento de SOX2. Usando este sistema, os níveis de SOX2 foram restabelecidos e observou-se uma diminuição nos níveis de Vimentina, sugerindo um retorno a um fenótipo de célula epitelial. Utilizando-se de um sistema TOPFLASH-FOPFLASH, observou-se que a expressão de SOX2é inibida por β-catenina, o que sugere um papel da via da sinalização por Wnt para o processo de EMT SOX2-dependente. Os nossos resultados sugerem que, durante as patologias proliferativas, existe uma regulação positiva da expressão SOX2, mas para a indução de EMT é necessária uma regulação negativa de SOX2dependente de β-catenina.

The transcription factor SOX2 regulates cellular identity in embryonic stem cells and facilitates the reprogramming of terminally differentiated somatic cells back to a pluripotent stem cell state. The decrease in SOX2 expression is indicative of worse prognosis and poor survival of cancer patients. Our hypothesis is that during the Oral Squamous Cell Carcinoma (OSCC) carcinogenesis process, there is a dysregulation of SOX2 expression, contributing to the invasive behavior of tumor cells in the extracellular matrix. We analyzed the expression of SOX2 in human biopsies of Oral Squamous Cell Carcinoma (OSCC) and Potentially Malignant Oral Lesion (PMOL). Biopsies of oral mucosa (without lesions, n=13), hyperplasic (n=6) and dysplastic (n=21) lesions (PMOLs) and high (n=12) or low (n=12) differentiated HNSCC were used to analyses the SOX2 expression by fluorescent in situ hybridization (FISH). In addition, immunohistochemistry detection of SOX2 and the mesenchymalmarker Vimentin were conducted. It was observed an increase on SOX2 expression at proliferative regions. In PMOLS and center of the tumor but not, at the OSCC invasion zones where cells underwent epithelial-tomesenchyme transition (EMT) process, SOX2 expression was reduced. Then, we analyzed the possible role of SOX2 in the EMT. We used the wellestablished OSCC tumor cell line FaDu and genetically modified clones in which the expression of the Kallikrein-related peptidase 6 (FaDu-shKLK6) was silenced employing shRNA. KLK6 belongs to a family of 15 secreted serine proteases, which depletion results in EMT an SOX2 silencing. Using this system, we restored SOX2 levels and observed a decrease in the Vimentin levels, suggesting a return to an epitheliallike phenotype. Using the TOPFLASH-FOPFLASH system, we observed that SOX2 expression is inhibited by β-catenin, which suggest a role for the Wnt signaling for the SOX2- dependent EMT process. Taken together, our results suggest that during proliferative disorders, there is an upregulation of SOX2 expression but it is necessary a β-catenin dependent downregulation of SOX2 for induction of EMT.