Validação de um método para a quantificação de compostos fenólicos por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrometria de massas de alta resolução para atender a demanda do laboratõrio do Instituto de Ciência e Tecnologia de Alimentos (HPLC-ESI-QToF-MS)

Abstract

Na literatura científica há evidências de que o consumo de alimentos ricos em compostos fenólicos está associado à diminuição de doenças crônico-degenerativas, tais como doenças cardiovasculares, neurodegenerativas e alguns tipos de câncer. Essas doenças possuem a sua etiologia relacionada ao estresse oxidativo e nitrosativo. Por hipótese, os compostos fenólicos presentes nos alimentos seriam capazes de auxiliar na manutenção do equilíbrio redox no organismo, através da desativação de espécies reativas de oxigênio (ROS) e de nitrogênio (RNS). Neste contexto, o conhecimento do perfil completo de compostos fenólicos presentes nos alimentos é de grande relevância para a compreensão do papel desses compostos para a saúde humana. Atualmente as duas técnicas mais utilizadas para quantificar os compostos fenólicos são a espectrofotometria, utilizando o método Folin-Ciocalteu, e a a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com detector de arranjo de diodos (DAD). O método Folin-Ciolcateu possui como principal limitação a sua grande susceptibilidade a interferentes presentes nos alimentos, o que acarreta superestimação nos resultados de compostos fenólicos totais. Os métodos baseados em HPLC-DAD possuem como principal limitante o grande número de coeluições observado no cromatograma obtido durante a separação desses compostos, o que impossibilita a quantificação de maneira confiável. Além disso, a HPLC-DAD possui limites de detecção e quantificação elevados, permitindo apenas a quantificação dos compostos fenólicos majoritários. Com o objetivo de superar essas limitações, nesse trabalho foi validado um método de HPLC acoplada a espectrometria de massas de alta resolução. A validação foi conduzida utilizando 10 padrões de compostos fenólicos, nomeadamente: ácido gálico (padrão interno), ácido hidroxibenzóico, catequina, epicatequina, ácido clorogênico, ácido cafeico, ácido cumárico, ácido ferúlico, rutina e quercetina-3-O-glicosídeo. Os seguintes parâmetros analíticos foram avaliados: linearidade, limites de detecção (LD) e quantificação (LQ), repetibilidade e recuperação. O método apresenta boa linearidade (R2 > 0,99) e baixos limites de detecção (0,02-1,73 mg.L-1) e quantificação (0,07- 5,24 mg.L-1). Esses valores de LD e LQ são cerca de 2 a 30 vezes menores do que aqueles obtidos pelo método de HPLC-DAD, o qual foi utilizado como referência nesse trabalho. Os resultados de recuperação foram aceitáveis para os três níveis de concentração testadas, variando de 65 a 123%. Os resultados de repetibilidade, estimados pelas triplicatas das recuperações, variaram de 2 a 13%. Por fim, o método validado foi aplicado em uma amostra de maçã e foram quantificados os dois compostos fenólicos majoritários, epicatequina e ácido clorogênico os quais apresentaram concentrações similares ao do método de referência HPLC-DAD e ao relatado na literatura. Assim, o método validado nesse trabalho pode ser utilizado para a quantificação de compostos fenólicos em alimentos, com a grande vantagem de não apresentar as coeluições apresentadas no método convencional de quantificação.

In the scientific literature there is evidence that the consumption of foods rich in phenolic compounds is associated with the decrease of chronic-degenerative diseases, such as cardiovascular diseases, neurodegenerative diseases and some types of cancer. These diseases have their etiology related to oxidative and nitrosative stress. By hypothesis, the phenolic compounds present in foods would be able to assist in the maintenance of the redox balance in the organism, through the deactivation of reactive oxygen species (ROS) and nitrogen (RNS). In this context, knowledge of the complete profile of phenolic compounds present in foods is of great relevance for understanding the role of these compounds in human health. Currently the two most used techniques to quantify phenolic compounds are spectrophotometry, using the Folin-Ciocalteu method, and high performance liquid chromatography (HPLC) with a diode array detector (DAD). The Folin-Ciolcateu method has as main limitation its great susceptibility to interferents present in food, which causes overestimation of the results of total phenolic compounds. The HPLC-DAD-based methods have as main limitation the large number of coelutions observed in the chromatogram obtained during the separation of these compounds, which makes it impossible to quantify in a reliable way. In addition, HPLC-DAD has high detection and quantification limits, allowing only the quantification of the major phenolic compounds..Currently, the most widely used technique for quantifying phenolic compounds in foods is high performance liquid chromatography (HPLC) with a diode array detector (DAD). The major limitation of this technique is the large number of coelutions observed in the chromatogram obtained during the separation of these compounds, which makes it impossible to quantify in a reliable manner. In addition, HPLC-DAD has high detection and quantification limits, allowing only the quantification of major phenolic compounds. In order to overcome these limitations, an HPLC method coupled with high resolution mass spectrometry was validated in this work. The validation was carried out using 10 standards of different classes of phenolic compounds, namely gallic acid (internal standard), hydroxybenzoic acid, catechin, epicatechin, chlorogenic acid, caffeic acid, coumaric acid, ferulic acid, rutin and quercetin-3-O- glycoside. The following analytical parameters were evaluated: linearity, limits of detection (LD) and quantification (LQ), repeatability and recovery. The method has good linearity (R2 > 0.99) and low detection limits (0.02 - 1.73 mg.L-1) and quantification (0.07 - 5.24 mg.L-1). These LD and LQ values are about 2 to 30 times lower than those obtained by the HPLC-DAD method, which was used as reference in this work. The recovery results were acceptable for the three concentration levels tested, ranging from 65 to 123%. The repeatability results were estimated by the triplicates of the recoveries, and these values ranged from 2 to 13%. Finally, the validated method was applied in an apple sample and the two major phenolic compounds, epicatechin and chlorogenic acid, were quantified, which presented similar concentrations to the HPLC-DAD reference method and to that reported in the literature. Thus, the validated method in this work can be used for the quantification of phenolic compounds in foods, with the great advantage of not presenting the coelutions presented in the conventional method of quantification.