Monitorização dos níveis de fenilalanina em pacientes com fenilcetonúria por meio de sangue impregnado em papel filtro : comparação de dois métodos

Abstract

Introdução: Os Erros Inatos do Metabolismo (EIM) são doenças genéticas causadas pela atividade deficiente de uma ou mais enzimas específicas ou por defeitos no transporte de proteínas. A fenilcetonúria (PKU) é um EIM causado pela atividade deficiente da fenilalanina-hidroxilase (PAH) que é responsável pela conversão de Fenilalanina (Phe) em Tirosina (Tyr). Esta doença pode ser detectada precocemente através da Triagem Neonatal e seu diagnóstico confirmado através da dosagem de aminoácidos por Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC). O excesso de Phe e o consequente desbalanço de aminoácidos causam efeito tóxico no Sistema Nervoso Central (SNC) e por consequência perda de funções cognitiva e déficit cognitivo. O tratamento atual é feito principalmente através de dieta restrita em Phe, suplementação de aminoácidos essenciais e acompanhamento laboratorial e clínico. É importante lembrar que o diagnóstico e o tratamento precoce podem levar a excelentes resultados na qualidade de vida destes pacientes. Objetivo: O objetivo do presente trabalho foi avaliar dois métodos distintos: um método fluorimétrico desenvolvido In House (método A) e o Kit comercial de Fenilalanina Neonatal (Neonatal Phenylalanine Kit – Perkin Elmer®) (método B) para detecção dos níveis de Phe em amostras de sangue impregnado em papel filtro (SIPF) em pacientes com PKU que estão em acompanhamento no ambulatório do Serviço de Genética Médica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (SGM-HCPA) e comparar estes resultados com os resultados obtidos por HPLC, o qual é considerado o padrão ouro para o diagnóstico e monitoramento de pacientes com PKU. Metodologia: Estudo transversal, prospectivo e observacional no qual foi realizada a determinação dos níveis de Phe em amostras de SIPF de pacientes com PKU acompanhados no ambulatório do SGM-HCPA.Os resultados obtidos foram comparados com os níveis de Phe apresentados, na mesma amostra, pelo método de HPLC (padrão ouro). As amostras foram obtidas a partir de sangue total heparinizado. Após a impregnação do sangue total no papel filtro a amostra foi centrifugada e houve a separação do plasma para a análise pelo método de HPLC. O papel filtro ficou secando a temperatura ambiente por no mínimo 4 horas e no máximo 24 horas. Após secagem total a amostra foi armazenada em saco plástico com sílica em freezer -80ºC até o dia da análise. Resultados: Foram analisadas 89 amostras de SIPF de 47 pacientes que são acompanhados no SGM-HCPA. Dos 47 pacientes testados, 20 (42,5%) possuem a forma clássica de PKU, 16 (34,1%) a forma leve da doença e em 11 o fenótipo não está definido. A correlação entre o método In House (método A) e o HPLC, e entre o Kit comercial de Fenilalanina Neonatal (método B) e o HPLC feita através da correlação de Spearman, o coeficiente angular, interceptação em y e correlação linear foram de 0,990, 1,0365, 3,8125, 09873 e 0,974, 1,0795, 31,98 e 0,895 respectivamente. O nível de significância das duas análises foi de p<0,05. Todas as amostras analisadas por HPLC que eram alteradas ou normais, também se mostraram da mesma forma com ambos os métodos testados. A análise feita através da razão do diagrama de Bland Altman mostrou que quanto menor o valor do HPLC, maior é a dispersão dos valores nos métodos A e B. Conclusões: Nossos testes sugerem que amostras de SIPF nos métodos A e B são boas alternativas para a monitorização dos níveis de Phe em pacientes com PKU, sendo que o método A apresentou maior concordância em relação ao padrão ouro.

Introduction: Inborn Errors of Metabolism (IEM) are genetic diseases caused by the absense of activity of one or more specific enzymes or by defects in the transport of proteins. Phenylketonuria (PKU) is an IEM caused by the deficiency of the phenylalanine hydroxylase (PAH), enzyme that is responsible for the conversion of Phenylalanine (Phe) into Tyrosine (Tyr). This disease can be detected early through Neonatal Screening and its diagnosis is confirmed through the measurement of amino acids by High Performance Liquid Chromatography (HPLC). The excess of Phe and the consequent amino acid imbalance cause toxic effect on the Central Nervous System (CNS) and consequently loss of cognitive function and cognitive deficit. The current treatment is mainly made through restricted diet in Phe, supplementation of essential amino acids and laboratory and clinical follow-up. It is important to remember that early diagnosis and treatment can lead to excellent results in the quality of life of these patients. Objective: The objective of the present study was to evaluate two different methods: a fluorimetric method developed In House (method A) and the commercial Neonatal Phenylalanine Kit (Perkin Elmer®) (method B) for the detection of Phe levels in dried blood spots samples (DBS) in patients with PKU who are being followed up at the ambulatory of the Medical Genetics Service of the Hospital de Clínicas of Porto Alegre (MGS-HCPA) and compare these results with the results obtained by HPLC, which is considered the gold standard for the diagnosis and monitoring of patients with PKU. Methodology: A cross-sectional, prospective and observational study in which the determination of Phe levels in DBS samples of patients with PKU was carried out in the MGS-HCPA outpatient clinic using two different methods: the In House (method A) and the commercial Neonatal Phenylalanine Kit (method B). The results obtained were compared with the Phe levels presented by the HPLC method (gold standard). Samples of DBS were obtained from heparinized whole blood. After impregnation of the whole blood on the filter paper the sample was centrifuged and the plasma separated for analysis by the HPLC method. The filter paper was dried at room temperature for at least 4 hours and at most 24 hours. After complete drying the sample was stored in plastic bag with silica in freezer -80ºC until the day of analysis. Results: A total of 89 DBS samples were analyzed from 47 patients who are followed up at GMS-HCPA. The correlation between the In House (method A) and HPLC, and between the commercial Neonatal Phenylalanine Kit (method B) and HPLC using Spearman's correlation, slope, y-intercept and linear correlation were 0.990, 1.0365, 3.8125, 09873 and 0.974, 1.0795, 31.98 and 0.895 respectively. The level of significance of the two analyzes was p <0.05. Of the 47 patients tested, 20 (42.5%) had the classic form of PKU, 16 (34.1%) the mild form of the disease and 11 (23.4%) were not yet genotyped. All samples analyzed by HPLC that were altered or normal, also showed the same way with both methods tested. The analysis done through the ratio of the Bland Altman diagram showed that the lower the HPLC value, the greater the dispersion of the values in methods A and B. Conclusions: Our tests suggest that DBS samples in methods A and B are good alternatives for the monitoring of Phe levels in patients with PKU, and method A showed greater agreement with the gold standard.