Investigação de polimorfismos no gene UCP2 e avaliação da expressão de microRNAs que bloqueiam esse gene em pacientes com diabetes mellitus tipo 1 e doença renal do diabetes

Abstract

A doença renal do diabetes (DRD) é uma complicação microvascular comum do diabetes mellitus (DM) que afeta cerca de 40% dos pacientes com DM tipo 1 (DM1) ou DM tipo 2 (DM2). A DRD é a principal causa de doença renal crônica terminal em pacientes que iniciam terapia de substituição renal e está associada com o aumento da mortalidade cardiovascular. Essa complicação é uma doença progressiva, clinicamente caracterizada por albuminúria e diminuição gradual da taxa de filtração glomerular (TFG). Estudos vêm demonstrando que além dos fatores de risco ambientais, fatores genéticos e epigenéticos também influenciam o desenvolvimento DRD. A proteína desacopladora 2 (UCP2) é uma proteína presente na membrana mitocondrial interna que atua diminuindo a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) pela cadeia respiratória mitocondrial. Como a produção aumentada de EROs é um mecanismo chave pelo qual a hiperglicemia leva as complicações crônicas do DM, o gene UCP2 é um gene candidato para essas complicações, incluindo a DRD. De fato, diferentes polimorfismos comuns nesse gene têm sido associados às complicações microvasculares do DM; entretanto, os estudos demonstram resultados conflitantes quanto à associação destes polimorfismos com o desenvolvimento da DRD. Sendo assim, realizou-se um estudo de caso-controle e uma meta-análise com o objetivo de investigar a associação dos polimorfismos -866G/A (rs659366) e Ins/Del no gene UCP2 com DRD em pacientes diabéticos. O estudo de caso-controle incluiu 385 pacientes com DM1 (223 pacientes sem DRD e 162 pacientes com DRD) coletados no Hospital de Clínicas de Porto Alegre. A genotipagem do polimorfismo Ins/Del foi realizada pela separação direta dos produtos de 14 PCR em gel de agarose 2,5% corado com GelRed™ e a do polimorfismo -866G/A, por PCR em tempo real. As frequências alélicas e genotípicas dos dois polimorfismos estudados, bem como dos haplótipos formados por eles, não diferiram significativamente entre casos e controles. Da mesma forma, as distribuições destes polimorfismos entre casos e controles foi similar quando se analisou os modelos de herança aditivo, dominante e recessivo. Na meta-análise foram incluídos três artigos (quatro estudos) da literatura que investigaram a associação dos polimorfismos -866G/A e Ins/Del no gene UCP2 com DRD, além dos dados do nosso estudo de caso-controle descrito acima. De acordo com o encontrado no nosso estudo de caso-controle, os resultados da meta-análise não demonstraram associação entre os polimorfismos estudados e a DRD, mesmo após análise para os diferentes modelos de herança genética. Como já mencionado, diversos estudos vêm demonstrando a associação de fatores epigenéticos, como os microRNAs (miRNAs), com o desenvolvimento da DRD. Os miRNAs são pequenas moléculas de RNA não-codificantes que regulam a expressão gênica, estando, assim, envolvidos em vários processos biológicos e patológicos. MiR-15a-5p e miR-30e-5p têm como um dos seus alvos o gene UCP2; portanto, podem regular a expressão de UCP2, influenciando os níveis de EROS e, consequentemente, podendo estar associados à DRD. Assim, realizou-se um estudo de caso-controle com o objetivo de avaliar a expressão dos miR-15a-5p e miR-30e-5p no plasma e urina de pacientes com DM1 e DRD e pacientes com DM1 sem essa complicação crônica. Neste estudo de caso-controle, a expressão dos dois miRNAs de interesse foi avaliada no plasma e urina de 40 pacientes com DM1 (17 sem DRD e 23 com DRD) usando-se a técnica de qPCR. Análises de bioinformática também foram realizadas buscando-se encontrar as vias patogênicas nas quais os miR-15a-5p e miR-30e-5p estão 15 envolvidos. Como resultado, encontrou-se uma diminuição desses miRNAs no plasma e urina de pacientes com DM1 e DRD quando comparado com pacientes com DM1 sem DRD. Análises de bioinformática demonstraram que os dois miRNAs regulam diversos genes que participam de vias relacionadas ao TGF-β, angiogenêse, apoptose, hipóxia e estresse oxidativo. Em conclusão, tanto no nosso estudo de caso-controle como na meta-análise não observamos nenhuma associação entre os polimorfismos -866G/A e Ins/Del no gene UCP2 e a DRD. Entretanto, nosso estudo de caso-controle que investigou a expressão dos miR-15a-5p e miR-30e-5p no plasma e urina de paciente com DM1 com e sem DRD, demonstrou que a expressão desses dois miRNAs está diminuída nos pacientes com DRD quando comparado ao grupo controle.

Diabetes kidney disease (DKD) is a common microvascular complication of diabetes mellitus (DM) that affects approximately 40% of patients with type 1 DM (T1DM) or type 2 DM (T2DM). DKD is the leading cause of end-stage renal disease in patients initiating renal replacement therapy and is associated with increased cardiovascular mortality. This complication is a progressive disease, clinically characterized by albuminuria and a gradual decrease in the glomerular filtration rate (GFR). Studies have shown that in addition to the environmental risk factors, genetic and epigenetic factors also influence DKD development. Uncoupling protein 2 (UCP2) is located in the mitochondrial internal membrane and decreases the production of reactive oxygen species (ROS) by the mitochondrial respiratory chain. Taking into account that increased ROS production is a key mechanism by which hyperglycemia leads to chronic diabetic complications, the UCP2 gene is a candidate gene for these complications, including DKD. In fact, different common polymorphisms in this gene have been associated with diabetic microvascular complications; however, studies have shown conflicting results regarding the association of these polymorphisms with the development of DKD. Thus, a case-control study and a meta-analysis were carried out to investigate the association of -866G/A (rs659366) and Ins/Del polymorphisms in UCP2 gene with DKD. The case-control study comprised 385 T1DM patients (223 patients without DKD and 162 patients with DKD) recruited at the Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Genotyping of Ins/Del polymorphism was performed by direct separation of PCR products in 2.5% agarose gel stained with GelRed ™, while genotyping of the -866G/A polymorphism was done by real-time PCR. Allele and genotype frequencies of the two 17 analyzed polymorphisms, as well as the haplotypes constituted by them, did not differ significantly between case and control groups. Likewise, distributions of these polymorphisms between cases and controls were similar when analyzing additive, dominant and recessive inheritance models. Our meta-analysis included three articles (four studies) that investigated the association of UCP2 -866G/A and Ins/Del polymorphisms with DKD plus the data from our present case-control study. According to the results found in our case-control study, meta-analysis showed no association between both analyzed polymorphisms and DKD, even after analysis of the different genetic inheritance models. As already mentioned, several studies have demonstrated the association of epigenetic factors, such as microRNAs (miRNAs), with the development of DKD. MiRNAs are small non-coding RNAs that regulate gene expression; hence, being involved in several biological and pathological processes. MiR-15a-5p and miR-30e-5p have as one of their targets the UCP2 gene; therefore, they might regulate UCP2 expression, influencing ROS levels and, consequently, be associated with DKD. Thus, a case-control study was conducted aiming to evaluate miR-15a-5p and miR-30e-5p expressions in plasma and urine of T1DM patients with DKD and T1DM patients without this chronic complication. In this case-control study, expression of the two miRNAs of interest was evaluated in plasma and urine of 40 patients with T1DM (17 without DKD and 23 with DKD) by qPCR. Bioinformatics analyses were also performed to find pathogenic pathways in which miR-15a-5p and miR-30e-5p are involved. As a result, these two miRNAs were downregulated in plasma and urine of T1DM patients with DKD compared to T1DM patients without this complication. Bioinformatics analyses showed that these miRNAs regulate several genes 18 that participate in pathways related to TGF-β, angiogenesis, apoptosis, hipoxia, and oxidative stress. In conclusion, both case-control and meta-analysis results were not able to demonstrate any association between the UCP2 -866G/A and Ins/Del polymorphisms with DKD. However, our case-control study that investigated the expression of miR-15a-5p and miR-30e-5p in plasma and urine of T1DM patient with and without DKD demonstrated that these two miRNAs are downregulated in patients with DKD when compared to the group control.