Análise retrospectiva por PCR metilação específica de pacientes diagnosticados com síndrome do X-frágil pela metodologia de PCR convencional

Abstract

A síndrome do X frágil é causada pela expansão da repetição de um trinucleotídeo CGG na região 5’ não traduzida do gene Fragile X Mental Retardation 1, mapeado no cromossomo Xq27.3. Indivíduos afetados apresentam a mutação plena, caracterizada por >200 repetições do trinucleotídeo CGG. Devido aos diversos aspectos moleculares envolvidos na síndrome do X frágil, o diagnóstico da doença envolve o emprego de uma combinação de diferentes métodos de análise, sendo necessária a padronização de métodos de triagem sensíveis, com alto rendimento e boa relação custo-benefício. O presente trabalho consistiu em analisar amostras de 28 indivíduos já diagnosticados com síndrome do X frágil no Serviço de Genética Médica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre no período de 2012 a 2015, pelo PCR convencional, empregando o método de PCR metilação-específica. Adicionalmente, 14 amostras de pacientes cujo resultado do PCR convencional foi negativo para a doença, foram submetidas a sequenciamento de Sanger, para determinar o número exato de repetições CGG. Dessas 14 amostras selecionadas para sequenciamento, 9 foram também analisadas através do sistema Agilent Tapestation 4200. Para 4 dessas amostras, dados obtidos previamente através do método Triplet-primed PCR estavam disponíveis. Dos 28 pacientes diagnosticados com síndrome do X frágil, 13 foram caracterizados como mosaicos, e um paciente foi reclassificado como pré-mutado. Das 14 amostras sequenciadas, apenas uma apresentou análise viável, as demais treze apresentaram leituras com background. Os resultados obtidos através do sistema Tapestation apresentaram resultados compatíveis com o padrão de corrida eletroforética em gel de agarose. A técnica de PCR-metilação específica pode ser associada à PCR convencional para proporcionar um diagnóstico mais acurado. A análise proposta neste trabalho será complementar à análise convencional já realizada na rotina do Hospital de Clínicas de Porto Alegre e irá beneficiar os pacientes possibilitando um diagnóstico mais acurado.

The Fragile X syndrome is caused by the expansion of a CGG trinucleotide repeat within the 5’ untranslated region of the Fragile X Mental Retardation 1 gene, mapped on the chromosome Xq27.3. Affected individuals have the full mutation which is characterized by >200 CGG repeats. Because of the several molecular aspects involved in the fragile X syndrome, the diagnosis requires a combination of different methods of analyses with high sensitivity, as well as high-throughput and cost-effective screening methods. The present study aimed to analyze samples from 28 individuals diagnosed with fragile X syndrome by conventional PCR, from the Medical Genetics Service of Hospital de Clínicas de Porto Alegre, from 2012 to 2015 by methylation-specific PCR. Additionally, 14 samples from patients whose conventional PCR results were negative for this disease were submitted to Sanger sequencing in order to determine the exact number of CGG repeats. For the 14 samples that undergone Sanger sequencing, 9 were also analyzed by the Tapestation system. Four of these samples have been previously analyzed by triplet-primed PCR. Among 28 patients diagnosed with FXS, 14 were characterized as mosaics, and 1 patient was reclassified as pre-mutation carrier. Among the 14 sequenced samples, only one of them was viable for analysis, whereas 13 showed background noise, compatible with unspecific amplification. The Tapestation system results were compatible with electrophoresis migrating pattern in agarose gel. Methylation-specific PCR technique might be associated to conventional PCR in order to provide more accurate diagnosis. The method of analysis proposed in this study will be complementary to the conventional analysis currently performed at Hospital de Clínicas de Porto Alegre, and will benefit patients, enabling a more accurate diagnosis.