Isolamento de marcadores microssatélites para Petunia integrifolia subesp. depauperata (Solanaceae) e Passiflora ovalis (Passifloraceae)

Abstract

Marcadores microssatélites são regiões do DNA compostas de pequenos motivos de um a seis nucleotídeos repetidos in tandem. Esses marcadores co-dominantes são altamente polimórficos e amplamente utilizados em diversos tipos de estudos devido a sua eficiência em determinar diferenças entre grupos, entre eles, estudos de genética de populações e conservação. Também, esses marcadores são apropriados na investigação de questões relacionadas aos processos históricos ocorridos em ambientes naturais através da análise dos padrões filogeográficos das espécies que neles habitam. Entender esses processos é de extrema relevância para a conservação de ambientes que se encontram sob constante pressão antrópica, como a Planície Costeira e a Mata Atlântica. Com intuito de contribuir para o entendimento desses processos, as espécies Petunia integrifolia subsp. depauperata e Passiflora ovalis foram selecionadas por se distribuírem ao longo da Planície Costeira e da Mata Atlântica, respectivamente, estando ameaçadas pela fragmentação de seus ambientes. O objetivo geral desse projeto foi a obtenção de um conjunto de marcadores microssatélites para estas espécies, visando sua aplicação em estudos evolutivos. Assim, o DNA total foi extraído e digerido, seguido da ligação de adaptadores para amplificação por PCR com “primers” específicos. Os fragmentos contendo microssatélites foram selecionados e clonados em vetor “TOPO TA cloning”, inserido em células competentes. Foram selecionadas 384 colônias transformadas de P. integrifolia subsp. depauperata e 312 de P. ovalis. Os clones de ambas as bibliotecas foram amplificados e sequenciados com os “primers” do vetor, resultando em um total de 481 sequências, das quais 411 foram únicas. Como resultado, aproximadamente 90% das sequências únicas continha repetições, 50 delas com tamanho adequado de repetição e região flanqueadora disponível para desenho de “primers”. Treze conjuntos de “primers” foram desenhados e sintetizados para P. integrifolia subsp. depauperata e 12 para P. ovalis. Esses resultados são condizentes com os demais encontrados para outras espécies de ambas as famílias botânicas, obtidos através do mesmo método selecionado para a obtenção dos conjuntos de “primers” neste trabalho. O desenvolvimento desses marcadores auxiliará no melhor entendimento da dinâmica populacional destas espécies e no estabelecimento de estratégias que priorizem a conservação de grupos que melhor representam a história evolutiva das espécies, identificando populações com maior variabilidade genética.

Microsatellites markers are repetitive DNA regions composed of small motifs of one to six nucleotides in tandem. These highly polymorphic co-dominant molecular markers are widely used in various studies, such as population and conservation genetics studies, for they are very efficient in determining differences among groups. As well, these markers are appropriate for investigating questions related to historical processes that took place in natural environments by analyzing the phylogeographical patterns of its inhabitant species. To understand these historical processes is very relevant for the conservation of environments that are under anthropic pressure, such as the Coastal Plain in Rio Grande do Sul and Santa Catarina, and the Atlantic Forest. To reconstruct this history, two species were chosen: Petunia integrifolia subsp. depauperata and Passiflora ovalis, selected for its distribution along the Coastal Plain and Atlantic Forest, respectively. Based on these questions, the aim of this study was to obtain a set of microsatellite markers for these species using an enrichment technique. To do so, the total DNA was extract and digested with the restriction enzymes RsaI and HaeIII to obtain fragments, followed by the ligation of oligo adapters to assure that every fragment has a common and known end for PCR amplification. The DNA fragments were then hybridized to biotinylated oligo probes and were selectively retained by magnetic beads linked to streptavidin. These selected fragments were amplified and linked to pCR 2.1-TOPO plasmid vector using TOPO TA cloning kit (Invitrogen). The potentially inserted plasmids were introduced into chemically competent Escherichia coli. Over 384 positive clones were selected for P. integrifolia subesp. depauperata, and 312 for P. ovalis. The clones were amplified and sequenced, resulting in 481 sequences, of which 411 were non-redundant. Approximately 90% of these unique sequences presented repeats, 50 of them adequate for primer design. Thirteen primers sets were designed for P. integrifolia subsp. depauperata and twelve for P. ovalis. These results are in accordance with others found for species of both botanical families, developed with the same methodology. The development of these markers will help to understand the population dynamics of these two species and to establish strategies that prioritize the conservation of groups that best represent the history of these species, identifying populations with higher genetic variability.