Avaliação imunológica de proteínas recombinantes produzidas em linhagens de Escherichia coli produtora e não produtora de lipopolissacarídeos endotóxicos

Abstract

Organismos-modelo são amplamente utilizados na pesquisa como um recurso fácil e uniforme de fazer estudos. A bactéria Escherichia coli é o modelo procariótico universal, amplamente utilizado para a expressão de proteínas recombinantes. Entre os estudos que utilizam proteínas recombinantes se destacam estudos imunológicos, como avaliação da resposta imune desencadeada em animais. Mus musculus se apresenta como um modelo imunológico extensamente utilizado para mamíferos. Contudo, proteínas recombinantes expressas em E. coli apresentam contaminação por lipopolissacarídeos (LPS), moléculas presentes na membrana externa de bactérias gram-negativas, que atuam como potente endotoxinas e desencadeiam resposta imune celular em contato com o sistema imune de mamíferos. Metodologias de remoção de LPS podem ser alternativas para esse problema. A linhagem de E. coli ClearColi BL21 (DE3) (ClearColi) também se apresenta como alternativa por sintetizar um precursor do LPS, o lipídeo IVA, que possui um caráter endotóxico mais fraco em comparação ao LPS. O antígeno B de Echinococcus granulosus (EgAgB) é um oligômero composto de diversas subunidades e reconhecidamente antigênico, contudo, por possuir um centro lipofílico, apresenta dificuldade na avaliação da resposta imune celular que produz. O objetivo desse trabalho é avaliar a resposta imune celular desencadeada em esplenócitos de camundongos BALB/c estimulados com a subunidade recombinante rEgAgB8/2 de EgAgB produzida em uma linhagem de E. coli tradicionalmente utilizada e produtora de LPS, a BL21-CodonPlus (DE3)-RIL (RIL), e em ClearColi, produtora do lipídeo IVA, com e sem o tratamento para remoção de LPS. Os esplenócitos estimulados foram avaliados quanto à produção das citocinas IFN-, IL-10 e IL-4, sendo utilizados como controles positivos a proteína altamente imunogênica Concavalina A e LPS purificado e, como controle negativo, a falta de estímulo. As análises apontaram diferença significativa com p ≤ 0,05 da produção de IFN- e IL-10 na presença do controle positivo Concavalina A em comparação aos outros estímulos, e ausência da produção de IL-4. Portanto, não há diferença entre a resposta imune celular desencadeada pela subunidade rEgAgB8/2 produzida pela E. coli RIL ou ClearColi, assim como não houve diferença entre as subunidades que sofreram e que não sofreram tratamento para remoção de LPS. Esses resultados são explicados pelo fato do oligômero formado pela subunidade rEgAgB8/2 possuir um centro lipofílico, evitando a remoção eficaz de LPS ou do lipídeo IVA pelo tratamento utilizado. Novas análises utilizando uma proteína recombinante que não possua caráter lipofílico são necessárias para avaliar a eficácia do tratamento de remoção de LPS.

Model organisms are widely used as an easy and solid tool in research. Escherichia coli is the universal prokaryotic model, being widely used for recombinant protein expression. Immunological analyses stand out among studies employing recombinant proteins, such as,the evaluation induced immune response in animals. Mus musculus is a widely used mammal immune model. However, recombinant proteins expressed in E. coli showed lipopolysaccharide (LPS) contamination. LPS are molecules present in the outer membrane of gram-negative bacteria that act as endotoxins leading to cellular immune response in mammals. LPS removal methodologies can be alternatives to this problem. The E. coli strain ClearColi BL21 (DE3) (ClearColi) also presents itself as an alternative because it synthesizes a precursor of LPS – the lipid IVA – which is a weaker endotoxin than LPS. Echinococcus granulosus antigen B (EgAgB) is an oligomer composed of several subunits that is very antigenic. However, by having a lipophilic center it is difficult to assess the cellular immune response it produces. The aim of this study is to evaluate the induced cellular immune response in splenocytes from BALB/c mice stimulated with recombinant subunit rEgAgB8/2 from EgAgB produced in the traditional LPS producer E. coli strain BL21-CodonPlus (DE3)-RIL (RIL) and in the lipid IVA producer ClearColi, with and without LPS removal treatment. The stimulated splenocytes were assessed for production of IFN-, IL-10 and IL-4. The highly immunogenic protein Concavalin A and purified LPS were used as positive controls and the lack of stimulation was used as negative control. The analyses showed significant difference (p ≤ 0.05) in IFN- and IL-10 production in the presence of Concavaline A in comparison to other stimuli. No production of IL-4 was observed for any stimuli. Therefore, there is no difference between the induced cellular immune response by subunit rEgAgB8/2 produced by RIL or ClearColi E. coli, as there was no difference between the subunits that have or have not suffered the LPS removal treatment. These results are explained by the fact that the subunit rEgAgB8/2 oligomer possesses a lipophilic center that prevents the effective LPS or lipid IVA removal. Further analysis using a recombinant protein that doesn’t have lipophilic character is needed to assess the efficacy of LPS removal treatment.