Análise da região promotora do gene OsAPx3 que codifica uma ascorbato peroxidase peroxissomal em arroz

Abstract

Ascorbato peroxidase (APx) é uma enzima fundamental do metabolismo antioxidante, que catalisa a decomposição do peróxido de hidrogênio em água, utilizando o ascorbato como doador de elétrons. O peróxido de hidrogênio é uma espécie reativa de oxigênio (ERO) que é produzida constantemente pelo metabolismo aeróbico, e em situações de estresse biótico ou abiótico tem sua produção aumentada, sendo que em grandes quantidades pode causar diversos danos celulares. Em arroz, APx é codificada por oito genes, cujos produtos são classificados por sua localização subcelular: citosólica, peroxissomal, mitocondrial ou cloroplastidial. A caracterização dos genes codificadores de APxs vem sendo feita e o estudo de promotores é uma ferramenta de grande importância que possibilita analisar o padrão de expressão global de genes em plantas. O objetivo deste trabalho foi estudar o padrão de expressão conferido pela sequência promotora do gene OsAPx3 de ascorbato peroxidase (peroxissomal). Para estas análises foi isolada uma sequência nucleotídica de aproximadamente 2 kb anterior ao sítio de iniciação da tradução do gene, a qual foi clonada no vetor de entrada pENTR e em seguida no vetor de destino , pHGWFS7, específico para o estudo de promotores O vetor contendo a sequência promotora, denominado PromAPx3, foi utilizado para a transformação de calos embriogênicos de arroz via Agrobacterium tumefaciens. Os calos transformados foram regenerados e cultivados em meio de seleção. Foram obtidas oito linhagens de plantas expressando Gus sob controle do promotor do gene OsAPx3 e a confirmação da transgenia foi verificada por PCR. Segmentos das plantas transformadas com o vetor PromAPx3 foram coletados e analisados por ensaios histoquímicos com X-Gluc . Em condição padrão, a expressão do gene Gus foi verificada em folhas, anteras, sendo a marcação nas anteras mais forte na fase R4, quando ocorre a antese. Em teste de seca houve repressão da expressão nas folhas-bandeira, e indução de expressão nas anteras. Análises in silico revelaram cis-elementos envolvidos na reposta a luz, anaerobiose, giberelina, ABA e falta de açúcar. Outros ensaios serão feitos e como perspectivas estão análises histoquímicas e quantificação fluorimétrica de GUS em outros tecidos vegetais, tanto em condições controle quanto em condições de estresse. Além disso, serão realizados testes experimentais para confirmar apredição dos cis-elementos da região promotora.

Ascorbate peroxidase (APx) is a key enzyme of the antioxidant metabolism, catalyzing the decomposition of hydrogen peroxide in water using ascorbate as electron donor. Hydrogen peroxide is a reactive oxygen species (ROS), which is constantly produced by aerobic metabolism, and under biotic and abiotic stress production is increased, and in large quantities can cause several cellular damage. In rice, the APx is encoded by eight genes, whose products are classified by their subcellular localization: cytosolic, peroxisomal, mitochondrial or chloroplastic. The characterization of genes encoding APXs has been taken and the study of promoters is a very important tool, which allows to analyze the global pattern of gene expression in plants. The aim of this work was to study the expression pattern of the promoter sequence of the gene OsAPx3 of ascorbate peroxidase (peroxisomal). For these analyzes, a 2 kb nucleotide sequence up stream to the translation start site of the gene was isolated and cloned into pENTR vector and then into the destiny vector pHGWFS7, specific for promoter analyses. The vector containing the promoter sequence called PromAPx3 was used for transformation of rice calli via Agrobacterium tumefaciens The transformed calli were regenerated into plants and grown in selective media. Eight lines expressing the Gus gene under the control of the OsAPX3 promoter were obtained. The confirmation of the transgene integration was carried out by PCR. Segments of the plants transformed with the vector PromAPx3 were collected and analyzed by histochemical assays with X-Gluc. In the control condition, the expression of Gus gene was detected in leaves and anthers, with the strongest staining in the anthers at R4 stage, when anthesis occurs. In drought test there was expression repressing in flag leaves, and induction of expression in anther. In silico analysis revealed the presence of cis elements of response to light, anaerobiosis, gibberellin, ABA and sugar shortage. Other tests will be done such as histochemical analysis and GUS fluorimetric quantification in other plant tissues, both in control conditions and under stress. Moreover, experimental tests to confirm the prediction of cis elements present in the promoter region will be carried out.