Expressão de microRNA em cerebelo no modelo animal de autismo induzido pela exposição prenatal ao ácido valproico

Abstract

O Transtorno do Espectro do Autismo (TEA) é uma desordem heterogênea, multifatorial e, segundo o DSM-5, diagnosticada através de uma díade comportamental que inclui déficits na comunicação e interação social e um repertório de atividades e interesses restritos. A etiologia do TEA ainda é desconhecida, mas se acredita que há uma interação complexa de fatores genéticos e ambientais envolvidos no desencadeamento do transtorno. A incidência do autismo vem aumentando desde seus primeiros estudos epidemiológicos, implicando no aumento do custo social do transtorno. Dentre os fatores de risco ambientais destaca-se o ácido valproico (VPA). O VPA é um anticonvulsivante sabidamente teratógeno que, quando utilizado durante o primeiro trimestre gestacional, aumenta em sete vezes o risco de o feto desenvolver TEA. Dessa maneira, a exposição pré-natal ao VPA foi demonstrada como um método adequado para indução de modelo animal deste transtorno e está bem estabelecido no nosso laboratório. Os estudos no TEA mostram um complexo envolvimento de diversas áreas cerebrais alteradas no autismo, incluindo o cerebelo. Diversas alterações moleculares, funcionais e morfológicas no cerebelo são relatadas tanto em pacientes com TEA como em modelos animais de autismo. Condições patológicas do cerebelo, como hipoplasia cerebelar e síndrome de Jubert apresentam naturalmente algumas características do tipo autista e ainda, há uma elevada incidência de desenvolvimento de TEA nesses pacientes. Além disso, diversos estudos têm mostrado alterações em níveis de microRNA (miRNA) em diversas amostras biológicas como sangue, tecidos encefálicos postmortem e cultura celular. Os miRNA modulam os níveis de proteínas ao se ligar ao seus RNAm alvos e impedir a tradução protéica via degradação do transcrito ou via bloqueio da translação ribossomal. Esse trabalho analisou o nível de expressão de um conjunto de miRNA em ratos de 30 dias do modelo animal de autismo induzido pela exposição pré-natal ao VPA. Ratas prenhes receberam uma única injeção intraperitoneal de VPA (600 mg/kg) ou de salina 0,9% delimitando os grupos VPA e controle. Aos 30 dias de vida os filhotes machos foram eutanasiados e tiveram suas estruturas encefálicas retiradas. O cerebelo foi imediatamente homogeneizado em Trizol e estocado em -80ºC. Para análise da expressão gênica foi utilizado RT-qPCR utilizando primers stem-loop para a síntese de cDNA. Os dados foram submetidos ao GeNorm para determinação dos miRNA normalizadores dentro do conjunto analisado. As expressões relativas foram XI calculadas pelo método considerando os valores de eficiência para cada miRNA através do método –ΔΔCt. A análise estatística foi realizada pelo teste t de Student através do GraphPad. Considerando um p<0,05 foi encontrado um aumento da expressão relativa do miR-132 e miR-181a. Uma busca por alvos através dos bancos de dados TargetScan, MiRDB e miRTarBase identificou alvos importantes no TEA. Os transcritos Mecp2 e Bcl2 são alvos validados tanto em humanos como em ratos do miR-132 e miR-181a respectivamente. Mecp2 codifica a proteína 2 ligante de metil-CpG que modula a transcrição de diversos genes envolvidos com o funcionamento neuronal e sináptico, muito importante no TEA. Portanto, níveis diminuídos de MECP2 estariam implicados em desregulação sináptica e neuronal. O transcrito Bcl2 codifica a proteína antiapoptótica BCL2. Níveis diminuídos de BCL2 poderiam influenciar taxas elevadas de apoptose no cerebelo, o que explicaria a perda neuronal e hipoplasia cerebelar. Fazse necessário analisar os níveis proteicos de MECP2 e BCL2 para explorar seu envolvimento com os miRNA alterados.