Isolamento de achyrobichalcona e 3-O-metilquercetina a partir de inflorescências de Achyrocline satureioides utilizando cromatografia em contracorrente de alta performance (HPCCC) e avaliação do potencial citotóxico in vitro em linhagem de câncer de mama MDA-MB-231

Abstract

Achyrocline satureioides (Lam.) DC. Asteraceae, conhecida popularmente como marcela, é uma espécie vegetal estudada sob os mais diversos aspectos, químico, tecnológico e farmacológico, sendo muitas de suas propriedades atribuídas aos constituintes fenólicos presentes na planta. As investigações sobre a composição química de extratos hidroetanólicos das inflorescências de Achyrocline satureioides demonstrou a presença dos flavonoides quercetina (QCT), luteolina (LUT) e 3-O-metilquercetina (3OMQ), os quais são metabólitos secundários frequentemente relacionados às atividades biológicas. Além desses flavonoides, a achyrobichalcona (ACB) uma bichalcona de estrutura química e ocorrência inéditas foi recentemente identificada na espécie. O primeiro capítulo da tese se refere ao estudo de revisão utilizando metodologias bibliométricas, sobre as produções científicas e tecnológicas referidas na base de dados do Web of Science do Institute for Scientific Information (ISI), pertencente a Thompson-ReutersTM Company envolvendo chalconas para o tratamento do câncer/tumores. O objetivo do estudo foi mapear as publicações científicas e tecnológicas na última década, de 2006 a 2016. As palavras-chave utilizadas foram: chalcona seguida pelo símbolo (*), câncer e tumor. Independentemente da origem destas chalconas, observou-se oportunidades para o desenvolvimento de produtos visando sua vetorização em alvos biológicos para o tratamento do câncer. seguinte se caracterizou pela obtenção simultânea de frações e substâncias isoladas, bem como a identificação de novos constituintes fenólicos de inflorescências de Achyrocline satureioides. Com o intuito de obter elevadas concentrações destas substâncias com o mínimo de interferentes possível, foram realizadas extrações sucessivas com soxhlet (com os solventes hexano, acetato de etila e metanol), seguido por etapas de isolamento e purificação utilizando técnica de cromatografia em contracorrente de alta performance (HPCCC). Esta segunda parte do trabalho foi realizado em duas etapas: 1) obtenção de duas frações enriquecidas por meio do fracionamento do extrato; e 2) isolamento de ACB e 3OMQ a partir destas frações enriquecidas. A análise da fração 1 (F1) revelou a presença de outros flavonoides-agliconas que foram analisados por cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada a detector de espectrometria de massa quadrupolo de alta definição (UPLC-QTOF/HDMS) e de ressonância magnética nuclear (RMN). Os constituintes foram identificados como canferol, isocanferol, 3,3’-di-O-metilquercetina, sendo a presença dos dois últimos relatada pela primeira vez em inflorescências da Achyrocline satureioides. A ACB e 3OMQ foram obtidas com alto grau de pureza e bom rendimento, a partir da F1 e F2, respectivamente, utilizando colunas semi-preparativa e analítica de HPCCC. Como resultado, obteve-se ACB e 3OMQ com alta pureza, respectivamente, 98% e 97% (p/p) e excelente rendimento a partir de extrato seco bruto obtido por sohxlet (69% e 65%, respectivamente), tornando estas substâncias adequadas para uso em estudos de atividade biológica. A etapa seguinte objetivou avaliar comparativamente as propriedades citotóxicas apresentadas pelos isolados, ACB e 3OMQ. Primeiramente, foi avaliado o efeito citotóxico das moléculas isoladas, ACB e 3OMQ, frente a uma linhagem celular de câncer de mama MDA-MB-231 e comparada à linhagem celular epitelial primária não transformada MCF-12A. Os resultados demonstraram que a ACB apresentou efeito citotóxico (GI50 16,68 μM) em relação à linhagem celular MDA-MB-231, com índice de seletividade superior a 2, quando comparado à linhagem MCF-12A. A 3OMQ também apresentou efeito citotóxico (GI50 43,69 μM) sobre o MDA-MB-231; no entanto, o índice de seletividade foi inferior a 2. Subsequentemente, analisou-se a ativação de caspases nas células MDA-MB-231 por citometria de imagem celular e Western Blot. ACB e 3OMQ não ativaram a caspase-8 (mecanismo extrínseco), mas foram capazes de ativar a caspase-3, caspase-7 e caspase-9. Os resultados sugerem que a apoptose na linhagem celular MDA-MB-231 foi induzida por meio de mecanismo intrínseco dependente de caspases. O conjunto de informações obtidas, somadas a maior seletividade demonstram que a ACB é um potente candidato a agente anticâncer.

Achyrocline satureioides (Lam.) DC. Asteraceae, popularly known as marcela, is a plant that has been widely studied in chemical, technological and pharmacological aspects, and became well known for its properties attributed to the phenolic constituents present in the species. The investigations on the chemical composition of hydroethanolic extracts of Achyrocline satureioides inflorescences have demonstrated the presence of flavonoids quercetin (QCT), luteolin (LUT) and 3-O-methylquercetin (3OMQ), secondary metabolites often correlated with biological activities. In addition to these flavonoids, the achyrobichalcone (ACB) a bichalcone with chemical structure and occurrence unprecedented was recently identified in the species. The first chapter of the thesis refers to a review study using bibliometric methodologies on the scientific and technological productions referred in the Web of Science database of the Institute for Scientific Information (ISI) belonging to Thompson-ReutersTM Company involving chalcones for the cancer/tumors treatment. The aim of the study was to map the scientific and technological publications in the last decade, from 2006 to 2016. The keywords used were: chalcone followed by the symbol (*), cancer and tumor. Regardless of the origin of these chalcones, there were opportunities for the development of products intended for vectorization in biological targets for cancer treatment. The next stage was characterized by the simultaneous obtaining of fractions and isolated substances, as well as the identification of new phenolic constituents of Achyrocline satureioides inflorescences. In order to obtain high concentrations of these substances with as little interfering compounds as possible, successive extractions using soxhlet (with hexane, ethyl acetate and methanol solvents) were carried out followed by isolation and purification steps using high performance countercurrent chromatography (HPCCC). This second part of the work was carried out in two steps: 1) obtaining two enriched fractions through extract fractionation; and 2) isolation of ACB and 3OMQ from these enriched fractions. The analysis of fraction 1 (F1) revealed the presence of other flavonoids-aglycones that were analyzed by ultra-high performance liquid chromatography coupled to high definition quadrupole mass spectrometry detector (UPLC-QTOF/HDMS) and nuclear magnetic resonance (NMR). The constituents were identified as kaempferol, isokaempferide, 3,3'-di-O-methylquercetin. The presence of the last two were reported for the first time in Achyrocline satureioides inflorescences. ACB and 3OMQ were obtained with high purity and good yield, from F1 and F2, respectively, using HPCCC semi-preparative and analytical columns. As result, ACB and 3OMQ were obtained with high purity, respectively, 98% and 97% (w/w) and excellent yield from dry extract obtained by sohxlet (69% and 65% respectively), make them available for biological studies. The next step was to evaluate the cytotoxic properties of the isolates, ACB and 3OMQ comparatively. First, the cytotoxic effect of the isolated molecules, ACB and 3OMQ, were evaluated against a MDA-MB-231 breast cancer cell line and compared to an MCF-12A non-transformed primary epithelial cell line. The results showed that the ACB presented a cytotoxic effect (GI50 16.68 μM) on MDA-MB-231 cell line, with a selectivity index higher than 2 when compared to the MCF-12A. 3OMQ also had a cytotoxic effect (GI50 43.69 μM) on MDA-MB-231, however, the selectivity index was less than 2. Subsequently, the activation of caspases in MDA-MB-231 cells were analyzed by cell imaging and Western blot analysis. ACB and 3OMQ did not activate caspase-8 (extrinsic mechanism) but were able to activate caspase-3, caspase-7 and caspase-9. The results suggest that apoptosis in the MDA-MB-231 cell line was induced by caspase-dependent intrinsic mechanism. The set of information obtained, added to the greater selectivity demonstrate that ACB is a potent candidate as anticancer agent.