Efeito da estimulação magnética estática em linhagem celular de neuroblastoma e neuroblastoma diferenciado

Abstract

Estimulação Magnética vem sendo utilizada no tratamento de várias patologias do sistema nervoso central, mas a compreensão de sua ação em nível celular precisa ser melhor investigada. Sendo assim, o objetivo principal desta dissertação foi estabelecer, em cultura celular, um método de Estimulação Magnética Estática (E- ME) e avaliar seu efeito em diferentes tipos celulares. Para tanto, foi desenvolvido um suporte de placa de cultura com ímãs NeFeB (neodímio-ferro-boro) com a forma cilíndrica de 12mm de diâmetro por 6mm de altura. Cada suporte apresenta seis ímãs espaçados, de modo que os campos magnéticos não interajam entre si. As células de neuroblastoma humano SH-SY5Y foram plaqueadas 1x106 células por poço e cultivadas em placas de 24 poços. A análise microscópica das placas demonstrou que as células adaptaram-se ao novo ambiente, demonstrando aderência e crescimento adequados à superfície da placa. Após este primeiro passo, as células SH-SY5Y foram estimuladas utilizando 0,1 T, 0,2 T e 0,3 T por 60 minutos, buscando determinar a melhor intensidade de EME. Após, este período de estimulação, para avaliar a viabilidade celular, foi realizado o ensaio de MTT (brometo de [3- (4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil tetrazolium) nos grupos de células estimuladas e não estimuladas. Não tendo sido observada diferença estatisticamente significativa entre os grupos avaliados. A partir da obtenção destes dados, foram definidos os parâmetros de intensidade e período de estimulação da EME. Os experimentos foram, então, realizados aplicando 24 horas de estimulação com intensidade de 0,3T em culturas de diferentes tipos celulares. Optamos por utilizar, além de células de neuroblastoma humano SH-SY5Y, outro tipo de células tumoral, células de melanoma vaginal; e células de neuroblastoma diferenciado em células neuronais e células mesenquimais derivadas de adipócitos. Com estas escolhas objetivamos determinar a resposta de diferentes tipos celulares a EME. Para tanto, cada tipo celular foi dividido em 4 grupos, 2 grupos não estimulados (controles) avaliadas imediatamente (CI) e 24h após o final do experimento (C24), e 2 grupos estimulados por 24h, que foram avaliados imediatamente (EI) e 24h após o final da exposição a EME (E24). Para verificar a resposta celular a EME foram avaliados parâmetros de toxicidade (MTT, PI (Iodeto de propídeo) e HO (Hoechst), de neuroplasticidade (expressão do gene do receptor de BDNF (PCR em tempo real)) e ciclo celular (citometria de fluxo). Os resultados obtidos demonstram que imediatamente após a EME, houve uma diminuição significativa na viabilidade celular das células SH-SY5Y indiferenciadas (Kruskal Wallis, P<0,05). Já no grupo 24h, não houve diferença estatisticamente significativa em nenhum dos gru 9 pos avaliados (Kruskal Wallis, P>0,05). Visto que, houve uma diminuição da viabili- dade celular nas células SH-SY5Y, imediatamente após a estimulação, na busca de encontrar o mecanismo de ação pelo qual estas células apresentavam uma diminui- ção celular, utilizamos as técnicas de PI e de HO para avaliar apoptose e necrose celular, respectivamente. Adicionalmente avaliamos o ciclo celular. Desta forma e, considerando que apenas as células de neuroblastoma humano SH-SY5Y apresen- taram diminuição significativa na viabilidade celular, somente neste tipo celular foi feito esta avaliação. Não foi encontrada diferença estatisticamente significativa entre os grupos. No entanto, a análise descritiva demonstrou que, 24h após o estímulo, as células SH-SY5Y não diferenciadas apresentaram uma redução de duplicação celular (Kruskal Wallis, P >0,05). Outro fator avaliado nas células SH-SY5Y diferenciadas e não diferenciadas, como parâmetro de neuroplasticidade, foi expressão do gene do receptor Trk-β. Não foi encontrada diferença significativa, no entanto na análise descritiva, as células SH-SY5Y não diferenciadas avaliadas 24h após a aplicação de EME, apresentaram um aumento na expressão deste gene, sugerindo um aumento da neuroplasticidade. Estes resultados demonstram um efeito de longa duração da EME, por pelo menos até 24h após o final da EME, corroborando com dados prévios de nosso grupo de pesquisa, utilizando modelos animais e ETCC (estimulação transcraniana por corrente contínua), outra técnica neuromodulatoria, que mostraram efeito por até 7 dias após o termino da tratamento. Interessantemente, não foram observadas diferenças na viabilidade celular nas de- mais culturas celulares analisadas. Estes resultados são muito relevantes, pois demonstram que, em relação aos parâmetros de viabilidade celular analisados, a EME é uma técnica segura no protocolo utilizado (24h de 0,3T de EME). Os dados desta dissertação demonstram que a EME apresenta diferentes efeitos em relação à toxicidade em células de tumores neuronais, tumores não neuronais e células com morfologia normal. A diminuição da viabilidade celular nas células SH-SY5Y indiferenciadas é um resultado surpreendente e favorável considerando ser linhagem celular tumoral. Desta forma estes resultados avaliados em conjunto sugerem que a EME é uma técnica segura que, em células normais não provocou alterações importantes nos parâmetros avaliados e em tumores de células não neuronais não alterou o crescimento celular. No entanto, ainda se faz necessário aumentar o numero amostral da avaliação das fases do ciclo celular a expressão do gene Trk-β, assim como mais estudos para avaliar outros parâmetros de toxicidade e também diferentes protocolos de estimulação celular utilizando a EME.

Magnetic stimulation has been used in the treatment of various pathologies of the central nervous system, but the understanding of its action at the cellular level needs to be investigated. Thus, the main objective of this dissertation was to establish, in cell culture, a method of Static Magnetic Stimulation (SMS). For this purpose, a cul- ture plate holder with NeFeB (neodymium-iron-boron) magnets with a cylindrical shape of 12mm in diameter by 6mm in height was developed. Cells were plated 1x106 cells per well and cultured in 24-well plates. Microscopic analysis of plaques demonstrated that the cells adapted to the new environment, demonstrating ade- quate adhesion and growth to the plaque surface. This was extremely important to the development of this article. After this first step, human neuroblastoma cells (SH- SY5Y) were stimulated using 0.1 T, 0.2 T and 0.3 T for 60 minutes, in order to de- termine the best intensity of static magnetic stimulation. After this stimulation period, to evaluate cell viability, the MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium] assay was performed on stimulated (stimulated group) and non- stimulated (control group) cells. No significant difference was observed between the groups evaluated. From the data obtained, it was defined the use of the highest in- tensity tested, an increase in the period of stimulation and application in other cell types. The experiments were then performed applying 24 hours of stimulation with 0.3T intensity in cultures of different cell types. Considering that the cells initially used were of neuronal tumor, we chose to use, in addition to human neuroblastoma cells, another type of tumor cells (vaginal melanoma cells), and cells with normal character- istics in their morphology, such as SH-SY5Y differentiated into neuronal cells and mesenchymal adipocyte-derived cells. With these choices we aimed to determine if different cell types would respond in the same way to SMS. In order to do so, each cell type was divided into 4 groups, 2 non-stimulated groups (controls) evaluated im- mediately (CI) and 24h at the end of the experiment (C24), 2 groups stimulated for 24h, which were evaluated immediately (SI) and 24h after the end of exposure to SMS (S24). To assess the cellular response to EME, toxicity parameters [MTT, PI (Propidium iodide) and HO (Hoechst)] and cell cycle (flow cytometry) were done. The results obtained demonstrate that immediately after SMS, a significant decrease in cell viability of undifferentiated SH-SY5Y cells was found (Kruskal Wallis, P <0.05). In the 24h group, there was no statistically significant difference in any of the groups evaluated (Kruskal Wallis, P> 0.05). Since there was a decrease in cell viability in SH-SY5Y cells, immediately after stimulation, in the search to find the mechanism of action by which these cells had a cellular decrease, we used the PI and HO tech- niques to evaluate apoptosis and death cell and respectively. Additionally, we evalu- ated the cell cycle. In this way, and considering that only SH-SY5Y human neuroblastoma cells showed a significant decrease in cell viability, only this cell type was evaluated. There were no statistically significant differences between groups. 11 However, the descriptive analysis demonstrated that, 24 h after the stimulus, undif- ferentiated SH-SY5Y cells present a decrease in cytoplasm division in the G1 phase and, in G2 phase, a decrease in nuclear division, leading to a reduction of cell dupli- cation (Kruskal Wallis, P> 0.05). Another factor evaluated in differentiated and undif- ferentiated SH-SY5Y cells as a parameter of neuroplasticity was expression of the Trk-β gene. No significant difference was found, however in the descriptive analysis, the undifferentiated SH-SY5Y cells evaluated 24h after the application of SMS showed an increase in the expression of this gene, suggesting an increase in neuro- plasticity. These results demonstrate a long-term effect of SMS for at least 24 hours after the end of the SMS, supporting previous data from our research group, using animal models and TDCs (transcranial direct current stimulation), and another neuromodulatory technique, which showed effect for up to 7 days after the end of treatment. Interestingly, no differences in cell viability were observed in the other cell cultures analyzed. These results are very relevant because they demonstrate that, in relation to the cell viability parameters analyzed; SMS is a safe technique in the pro- tocol used (24h of 0.3T of SMS). The data from this dissertation demonstrate that SMS has different effects in relation to toxicity in cells of neuronal tumors, non- neuronal tumors and cells with normal morphology. Decreased cell viability in undif- ferentiated SH-SY5Y cells is a surprising and favorable finding considering that it is a tumor cell line. Thus, these results evaluated together suggest that SMS is a safe technique that in normal cells did not induce important changes in the evaluated pa- rameters and in non-neuronal cell tumors did not alter the cell growth. However, it is still necessary to increase the sample number of the evaluation of the phases of the cell cycle and the expression of the Trk-β gene, as well as more studies to evaluate other parameters of toxicity and also different protocols of cellular stimulation using SMS.