O envolvimento de microRNAs no diabetes mellitus tipo 1 e na doença renal do diabetes

Abstract

Os microRNAs (miRNAs) são pequenas moléculas de RNA que regulam a expressão gênica e, por isso, estão envolvidos em vários processos biológicos e patológicos. Evidências sugerem que os miRNAs possuem um papel tanto no sistema imune quanto na proliferação, metabolismo e morte das células beta pancreáticas, os quais são processos envolvidos na patogênese do diabetes mellitus tipo 1 (DM1). Diversos estudos investigaram se perfis de expressão de miRNAs estão associados ao DM1; no entanto, seus resultados são ainda inconclusivos. Sendo assim, realizou-se uma revisão sistemática e um estudo caso-controle, seguidos de análises de bioinformática, com o objetivo de se identificar um perfil de expressão de miRNAs em pacientes com DM1. A revisão sistemática incluiu 33 estudos que investigaram a expressão de miRNAs em indivíduos com e sem DM1 e em modelos animais dessa doença. Em geral, 11 miRNAs circulantes no sangue estavam consistentemente desregulados em pacientes com DM1 comparado aos indivíduos controles. Desses 11 miRNAs, miR- 146a-5p, miR-150-5p, miR-342-3p e miR-1275 estavam menos expressos em pacientes com DM1 comparado aos controles; enquanto miR-21-5p, miR-24-3p, miR-100-5p, miR-148a-3p, miR-181a-5p, miR-210-3p e miR-375 estavam mais expressos em pacientes com DM1. Além disso, análises in silico demonstraram que esses 11 miRNAs estão envolvidos em vias relacionadas a funções do sistema imune, apoptoso e biossíntese de insulina, sugerindo que esses miRNAs podem ter um papel importante na patogênese do DM1. No estudo caso-controle, a expressão de 48 miRNAs foi analisada no plasma de 33 pacientes com DM1 (casos) e de 26 indivíduos não-diabéticos (controles), utilizando-se a técnica de macroarray. Em seguida, cinco miRNAs diferencialmente expressos entre casos e controles foram selecionados para a análise de validação dos resultados de expressão, em uma amostra independente (27 casos e 14 controles), utilizando-se RT-qPCR. Como resultado da análise de macroarray, nove miRNAs foram diferencialmente expressos em pacientes com diagnóstico recente de DM1 (<5 anos de diagnóstico) comparado com pacientes diabéticos com 5 anos de diagnóstico e indivíduos controles. Nenhuma diferença foi observada entre pacientes com DM1 com 5 anos de diagnóstico e o grupo controle. Além disso, a expressão aumentada dos miR- 103a-3p, miR-155-5p, miR-200a-3p e miR-210-3p, bem como a expressão diminuída do miR-146a-5p nos pacientes com DM1 de diagnóstico recente comparado aos outros dois grupos foram confirmadas utilizando-se RT-qPCR. As análises de bioinformática evidenciaram que esses cinco miRNAs regulam genes de vias associadas ao DM1, como sistema imune inato, MAPK, apoptose e insulina. Além dos estudos de expressão de miRNAs, evidências recentes demonstraram que polimorfismos em genes codificantes de miRNAs podem alterar a biogênese dos miRNAs, bem como suas ligações aos RNAm alvos, conferindo, assim, suscetibilidade para algumas doenças. Sendo assim, as frequências dos polimorfismos rs2910164 no miR-146a, rs767649 no miR-155 e rs6715345 no miR-375 foram investigadas em 490 pacientes com DM1 e em 469 indivíduos não-diabéticos. Os alelos mais raros dos polimorfismos rs2910164 no miR-146a e rs767649 no miR-155 foram menos frequentes em pacientes com DM1 do que nos controles. A associação desses alelos com proteção para o DM1 foi confirmada no modelo de herança dominante [polimorfismo rs2910164: Razão de chances (RC) = 0,56 (IC 95% 0,36 – 0,87); polimorfismo rs767649: RC = 0,51 (IC 95% 0,26 – 0,97)], ajustando-se para idade, etnia e haplótipo HLA DR/DQ de alto risco para o DM1. As frequências alélicas e genotípicas do polimorfismo rs6715345 no miR-375 não diferiram entre casos e controles. Além dos miRNAs estarem envolvidos na patogênese do DM1, diversos estudos demonstraram que a expressão desregulada de miRNAs também pode estar envolvida nas complicações crônicas do DM1, como a doença renal do diabetes (DRD); entretanto, os resultados em relação à DRD também são inconclusivos. A fim de proporcionar um melhor entendimento sobre o papel dos miRNAs na DRD, realizamos uma revisão sistemática e um estudo caso-controle, seguidos de análises in silico, visando a identificação de um perfil de expressão de miRNAs associados com essa complicação. A revisão sistemática incluiu 27 estudos que investigaram a expressão de miRNAs em pacientes com DRD e em indivíduos controles. Como resultado, seis miRNAs estavam consistentemente desregulados em pacientes com diferentes graus de DRD comparados aos controles (pacientes com DM1 sem DRD e/ou indivíduos saudáveis). Desses seis miRNAs, miR-21-5p, miR-29a-3p, miR-126-3p, miR-214-3p e miR-342-3p estavam aumentados, enquanto o miR-192-5p estava diminuído em pacientes com DRD comparado aos controles. A análise de bioinformática evidenciou que esses miRNAs regulam genes que participam de vias como apoptose, fibrose e acúmulo de proteínas na matriz extracelular, demonstrando que eles podem ter um papel importante na patogênese da DRD. No estudo caso-controle, investigamos a expressão de 48 miRNAs no plasma de 23 pacientes >10 anos de DM1 (controles DM1), 35 pacientes com diferentes graus de DRD (casos) e 10 indivíduos saudáveis, através de análise de macroarray. Posteriormente, cinco miRNAs desregulados nos casos foram escolhidos para validação em uma amostra independente (10 controles com DM1, 19 casos e 10 indivíduos saudáveis), utilizando-se RT-qPCR. Como resultado do macroarray, nove miRNAs foram diferencialmente expressos em pacientes com DRD comparados aos controles DM1. A expressão aumentada dos miR-21-3p e miR-378a-5p e a expressão diminuída dos miR-16-5p e miR-29a-3p nos pacientes com DRD comparado aos controles DM1 foi confirmada na amostra de validação. Não foi confirmada a associação do miR-503- 5p com DM1. A análise in silico demonstrou que os cinco miRNAs selecionados para a validação regulam genes das vias PI3K/Akt, longevidade, TGF-β1 e relaxina, o que indica que esses miRNAs podem ter um papel importante na patogênese da DRD.

MicroRNAs (miRNAs) are small RNA molecules that regulate gene expression; consequently they are involved in several biological and pathological processes. Growing evidence suggests that miRNAs play a key role in immune system functions as well as in pancreatic beta-cell metabolism, proliferation and death, which are processes involved in type 1 diabetes mellitus (T1DM) pathogenesis. Several studies have investigated if miRNA expression profiles are associated with T1DM; however, their results are still inconclusive. Thus, we performed a systematic review and a case-control study, both followed by bioinformatic analysis, aiming to identify a miRNA expression profile associated with T1DM. The systematic review included 33 studies that analyzed miRNA expressions in T1DM patients (cases) and nondiabetic subjects (controls) or in murine models of this disease. In general, 11 circulating miRNAs were consistently dysregulated in cases compared to controls. Among these 11 miRNAs, miR-146a-5p, miR-150-5p, miR-342- 3p e miR-1275 were downregulated in T1DM patients compared to controls; while, miR-21-5p, miR-24-3p, miR-100-5p, miR-148a-3p, miR-181a-5p, miR-210-3p e miR- 375 were upregulated in T1DM patients. Moreover, in silico analysis showed that these 11 miRNAs are involved in pathways related to the imune system, apoptosis and insulin biosynthesis, suggesting that these miRNAs could be involved in T1DM pathogenesis. In the case-control study, expressions of 48 miRNAs were analyzed in plasma of 33 T1DM patients (cases) and 26 age- and gender-matched nondiabetic subjects (controls), using a macroarray technique. After that, five differently expressed miRNAs between cases and controls were selected for validation of their results in an independente sample (27 cases and 14 controls), using RT-qPCR. As result of the macroarray analysis, nine miRNAs were diferently expressed in plasma of recentlydiagnosed T1DM patients (< 5 years of diagnosis) compared to T1DM patients with ≥ 5 years of diagnosis and controls. No differences in miRNA expressions were detected between controls and T1DM patients with ≥ 5 years of diagnosis. Moreover, miR-103a- 3p, miR-155-5p, miR-200a-3p, and miR-210-3p were confirmed as being upregulated in recently-diagnosed T1DM patients compared to the other two groups, using RT-qPCR. In the same way, miR-146a-5p was confirmed as being downregulated in recentlydiagnosed T1DM patients compared to the other groups. Bioinformatic analysis demonstrated that these five miRNAs regulate several genes from pathways associated with T1DM, such as innate immune system-, MAPK-, apoptosis-, -and insulin pathways. In addition to the miRNA expression studies, recent evidence has shown that polymorphisms in genes codifying miRNAs may alter their biogenesis as well as their binding to the corresponding mRNAs; thus, confering susceptibility for a given disease. Therefore, frequencies of miR-146a rs2910164, miR-155 rs767649 and miR-375 rs6715345 polymorphisms were analyzed in 490 T1DM patients and 469 nondiabetic subjects. Frequencies of the minor alleles of miR-146a rs2910164 and miR-155 rs767649 polymorphisms were lower in T1DM patients compared to nondiabetic subjects. Their association with T1DM protection was confirmed for the dominant model of inheritance [rs2910164 polymorphism: Odds ratio (OR) = 0.557, 95% CI 0.355 – 0.874; rs767649 polymorphism: OR = 0.508, 95% CI 0.265 – 0.973], after adjustment for age, ethnicity, and T1DM high-risk HLA DR/DQ haplotypes. MiR-375 rs6715345 allele and genotype frequencies did not differ between cases and controls. In addition to the miRNAs involved in T1DM pathogenesis, a number of studies have shown that dysregulated miRNAs expressions may also be involved in chronic complications of T1DM, such as diabetic kidney disease (DKD); however, the results in relation to DKD are also inconclusive. In order to provide a better understanding about the relantionship between miRNAs and DKD, we performed a systematic review and a case-control study, both followed by in silico analysis, aiming to identify a miRNA expression profile associated with this chronic complication. The systematic review included 27 studies that compared miRNA expressions between patients with DKD (cases) and control subjects. As result, six miRNAs were consistently dysregulated in patients with different stages of DKD compared to controls (T1DM patients without DKD or healthy individuals). Among these six miRNAs, miR- 21-5p, miR-29a-3p, miR-126-3p, miR-214-3p, and miR-342-3p were upregulated, while, miR-192-5p was downregulated in DKD cases compared to controls. Bioinformatic analysis indicated that these six miRNAs regulate genes involved in pathways related to DKD pathogenesis, such as apoptosis, fibrosis, and extracellular matrix accumulation. In the case-control study, we analyzed expressions of 48 miRNAs in plasma of 23 patients with > 10 years of T1DM diagnosis (T1DM controls), 35 patients with diferent stages of DKD and 10 healthy subjects using macroarray analysis. Five dysregulated miRNAs in T1DM cases were then selected for validation in an independent sample (10 T1DM controls, 19 DKD cases, and 10 healthy subjects), using RT-qPCR. As result, nine miRNAs were differentially expressed between DKD cases and T1DM controls. After validation, miR-21-3p and miR-378-3p were confirmed as being upregulated, while miR-16-5p and miR-29a-3p were confirmed as being downregulated in DKD cases compared to T1DM controls. The association between miR-503-5p expression and T1DM was not confirmed. The in silico analysis indicated that the five miRNAs choosen for validation regulate genes from PI3K/Akt, longevity, TGF-β1, and relaxin signaling pathways, reinforcing that these miRNAs have a role in DKD pathogenesis.