Obtenção de fração enriquecida em isoflavonas de Trifolium pratense L e avaliação da permeação cutânea de formononetina e biochanina A incorporadas em hidrogel de HPMC contendo ciclodextrinas

Abstract

A formononetina e a biochanina A são as isoflavonas majoritárias nas partes aéreas de Trifolium pratense L. (trevo-vermelho) relacionadas com as principais atividades farmacológicas da planta. São chamadas de fitoestrógenos, pois possuem estrutura similar ao do 17-β-estradiol, e são capazes de se ligar aos receptores estrogênicos (ERβ e ERα). As isoflavonas agliconas são moléculas de baixa hidrossolubilidade, o que pode limitar sua aplicação em produtos para pele e a expressão de sua atividade biológica. O presente trabalho tem como objetivo obter uma fração enriquecida em isoflavonas de T. pratense e avaliar a permeação cutânea das agliconas formononetina e biochanina A individualmente e associadas. Adicionalmente, o efeito de promoção da permeação cutânea em pele de orelha suina também foi objeto do estudo. A fração foi preparada por maceração e após precipitação das isoflavonas agliconas por evaporação do etanol, o precipitado foi separado por filtração e purificado por cromatografia em coluna de poliamida. O produto foi seco e apresentou concentração de isoflavonas de 2,8 mg/g de formononetina e 2,7 mg/g de biochanina A. No entanto, essa concentração ainda não foi suficiente para posterior incorporação em uma formulação visando testes de permeação cutanea. Neste contexto, os estudos de permeação em pele de orelha de suíno (Franz cells) foram realizados com as isoflavonas majoritárias de referência incorporadas à hidrogéis de hidroxipropilmetilcellulose (HPMC). Para avaliar o teor de isoflavonas nas formulações e nas diferentes camadas da pele foi desenvolvido método bioanalítico utilizando cromatografia líquida de alta eficiência, o qual mostrou-se linear, específico, exato, preciso e robusto. Os hidrogéis foram desenvolvidos utilizando como polímero HPMC (3,5%, m/v) e as isoflavonas (0,1%) foram incorporadas à essa base, individualmente ou associadas, em presença ou ausência de hidroxipropil-β-ciclodextrina (HPβCD) ou metil-β-ciclodextrina (MβCD). Os resultados obtidos na avaliação da permeação cutânea revelaram que as isoflavonas permearam mais quando incorporadas individualmente na base especialmente a formononetina. A biochanina A apresentou maior capacidade de permeação do que a formononetina, alcançando concentrações na epiderme de 0,5 ug/cm2 e na derme de 1,5 μg/cm2, representando cerca de 2,7 vezes mais comparando com a concentração de formononetina (respectivamente, 0,2 μg/cm2 e 0,4 μg/cm2). uso de ciclodextrinas aumentou significativamente a permeação da formononetina, tanto na epiderme quanto na derme. Para a biochanina A, apenas a retenção na epiderme foi aumentada com a presença de ciclodextrinas. A HPβCD foi a ciclodextrina que apresentou os melhores resultados de promoção da permeação da formononetina na derme e epiderme, proporcionando um aumento de 113%. Para a biochanina A, as duas ciclodextrinas aumentaram a sua concentração na epiderme na mesma proporção (37%). Quando as duas isoflavonas foram incorporadas em misturas 1:1 no hidrogel, a formononetina apresentou menor retenção, tanto na epiderme (0,1 μg/cm2) quanto na derme (0,4 μg/cm2). Contrariamente, a biochanina A apresentou retenção semelhante àquela apresentada quando foi incorporada isoladamente no hidrogel, caracterizando-se como uma molécula mais permeável e não sofrendo interferência da formononetina na sua permeação e retenção. Não foi observado efeito significativo da presença das ciclodextrinas na promoção da permeação cutânea das isoflavonas nas misturas, exceto para a formononetina, na epiderme. O conjunto dos resultados demonstrou que a formononetina e biochanina A são capazes de permear a pele sendo majoritariamente retidas na epiderme e na derme, revelando o seu potencial uso em preparações cosméticas destinadas à prevenção do envelhecimento cutâneo. As ciclodextrinas apresentaram acentuado efeito promotor da permeação cutânea apenas para a formononetina, que apresenta menor permeabilidade.

The main isoflavones present Trifolium pratense L. (red clover) aereal parts are the isoflavones formononetin and biochanin A, related to its pharmacological activities. These compounds are known as phytoestrogens due to its similarity to the structure of 17-β-estradiol, being able to bind to the estrogen receptor (ERβ and ERα). Aglicones of isoflavones display low water solubility limiting its incorporation in products for the skin and expression of its biological activity. The present work aims to develop a isoflavones-enriched fraction of T. pratense and to evaluate the skin permeation of the aglicones formononetin and biochanin A individually, and in association. Moreover the promoter effect of cyclodextrins on their skin permeation will also be evaluated. The enriched-fraction was prepared by maceration in ethanol 40% (v/v). The ethanol was evaporated and the dispersion was filtered. The supernatant was purified using a column chromatography packet with polyamide. The final product was dried and presented a concentration of 2.8 mg/g of formononetin and 2.7 mg/g of biochanin A. However, these amounts of isoflavones were not enough for subsequent incorporation into a formulation to proceed the cutaneous permeation tests. In this context, the permeation studies were performed using the chemical reference formononetin and biochanin A, incorporated into the hydroxypropyl methylcellulose (HPMC) hydrogels for the permeation studies on porcine ear skin (Franz cells). To evaluate the isoflavone concentration in the formulations and in the different skin layers, a bioanalytical method was validated using high performance liquid chromatography (HPLC), which showed linearity, specificity, accuracy, precision and robusteness. Hydrogels were developed using HPMC (Methocel® K4M) polymer (3.5%, m/v) and the isoflavones were incorporated into this base individually or in combination, in the presence or absence of hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPβCD) or methyl-β-cyclodextrin (MβCD). The results obtained in the cutaneous permeation tests showed higher permeation values when the isoflavones were individually incorporated into the formulations especially for formononetin. Biochanin A showed higher permeation capacity when compared to formononetin, reaching 0.5 μg/cm2 in the epidermis and 1.5 μg/cm2 in the dermis, representing about 2.7 times the concentration of formononetin (0.2 μg/cm2 and 0.4 μg/cm2). The use of cyclodextrins increased significantly the permeation values of formononetin, both in the epidermis and in the dermis. For biochanin A only the retention in the epidermis was increased. HPβCD was the cyclodextrin that showed the best results for formononetin as permeation promoter, providing an increasing in the epidermis and dermis of 113%. Both cyclodextrins improved the biochanin A permeation in the same proportion in the epidermis (37%). When the isoflavones were incorporated into hydrogels together (1:1 ratio), formononetin showed less retention in both skin layers (0.1 μg/cm2 in the epidermis and 0.4 μg/cm2 in the dermis) and biochanin A remained with similar performance when added alone. In the presence of cyclodextrins, no significant effect was observed in the promotion of skin permeation of isoflavones in mixtures, except for formononetin, in the epidermis. Taken together, the results indicated that formononetin and biochanin A present skin permeation being mostly retained in the epidermis and dermis, revealing its potential use in cosmetic products preparations for preventing skin aging. Cyclodextrins presented a marked skin permeation promoting effect only on formononetin, which molecule presents lower permeability.