Perfil da captação de glutamato em diferentes modelos de isquemia cerebral em ratos : injúria x neuroproteção

Abstract

A isquemia cerebral é a terceira maior causa de morte em países industrializados, sendo a maior causa de morbidade e mortalidade em indivíduos de meia idade e idosos. A redução do suprimento de glicose e oxigênio ao cérebro, o que ocorre na isquemia, leva a uma complexa cascata de eventos celulares, resultando em degeneração neuronal e, conseqüentemente, na perda das funções cerebrais. Altas concentrações extracelulares de glutamato ocorrem em decorrência a um episódio isquêmico devido ao bloqueio da captação de glutamato, assim como ao aumento na sua liberação e a uma reversão de seus transportadores. A manutenção de seus níveis abaixo dos neurotóxicos é realizada por transportadores de alta afinidade dependentes de sódio, principalmente nos astrócitos. Modelos de isquemia in vitro e in vivo foram utilizados nos trabalhos que compõem esta tese. No primeiro capítulo, usamos um modelo de privação de oxigênio e glicose (POG) em fatias de hipocampo de ratos jovens e adultos. A POG diminuiu a captação de glutamato em todos os tempos de reperfusão estudados em ambas as idades, sendo essa diminuição menos pronunciada em animais jovens. Fatias de hipocampo de animais adultos parecem ser mais resistentes ao insulto que as provenientes de animais jovens, visto que o dano celular se dá primeiramente nestes. A guanosina (GUO) foi capaz de evitar a queda da captação somente em animais jovens 3hs após a POG e também foi capaz de reduzir o dano celular em ambas as idades. A padronização da metodologia da captação de glutamato em cultura organotípica de fatias de hipocampo foi montada a fim de estudar alterações neste parâmetro após a POG. Nesse modelo, há um aumento da captação após 1h de reperfusão e uma queda após 24hs. A morte celular medida, pela incorporação de iodeto de propídio, foi significativa a partir das 13hs e há uma queda nos níveis de GLT-1 24hs pós-POG. A GUO protegeu parcialmente a morte induzida pela POG, mas não foi capaz de reverter a queda da captação de glutamato 24hs pós-insulto. O modelo in vivo de isquemia utilizado foi a hipóxia-isquemia (HI) neonatal. Houve um aumento da captação de glutamato 24hs pós-insulto no hemisfério ipsilateral e uma queda significativa 72hs após nos dois hemisférios. Alterações de GFAP e S100B foram analisadas. Houve um aumento dos níveis de GFAP dependente de idade nos três tempos estudados e nas duas estruturas. Nos animais submetidos à HI, o aumento de GFAP foi significativamente maior no hemisfério ipsilateral e esse foi diferente de seu respectivo controle 48 e 72hs após o insulto. Houve um aumento nos níveis de S100B dependente de idade no córtex, sem diferença entre o grupo controle e o HI. No hipocampo ipsilateral, observamos um aumento de S100B dependente de tempo no grupo HI e HI-GUO, mas somente o grupo HI-GUO foi diferente de seu controle 48 e 72hs após o insulto. A GUO não teve nenhum efeito sobre a captação de glutamato em córtex, sobre os níveis de GFAP em ambas as estruturas e sobre a S100B em córtex. O APDC, um potente agonista de receptor metabotrópico de grupo II, foi testado no modelo in vitro de POG com fatias de hipocampo. Ele foi capaz de evitar, parcialmente, a queda da captação de glutamato e esse efeito foi inibido por APICA, um antagonista de grupo II. Esses dados são preliminares e necessitam de maiores estudos. Podemos concluir que quando se usam diferentes modelos experimentais, tanto in vitro quanto in vivo, estes podem nos fornecer dados distintos sobre um mesmo parâmetro ou uma mesma droga em estudo e, mesmo assim, são importantes, pois cada modelo pode representar uma situação completamente diferente da outra.

Cerebral ischemia is the third leading cause of death in the industrialized countries being the major cause of morbidity and mortality in middle and later life. The reduction in the supply of glucose and oxygen to the brain that occurs in cerebral ischemia leads to a complex cascade of cellular events, resulting in neuronal degeneration and, consequently, in loss of brain functions. It has been shown that stroke and ischemia increase the extracellular glutamate levels due to impairment of glutamate uptake, as well as an increase in glutamate release and reversal of glutamate transporters. The maintenance of extracellular glutamate below neurotoxic levels is an essential role for glial cells and this is achieved through high affinity sodium-dependent glutamate transporters present mainly in astrocytes. Ischemic models in vitro and in vivo were used in this work. In the first chapter, we used a model of oxygen and glucose deprivation (OGD) in hippocampal slices of young and adult rats. OGD decreased glutamate uptake in all reperfusion times and in both ages studied, being this decrease less pronounced in young rats. Hippocampal slices of adult animals seemed to be more resistant to OGD than youngs, since cell damage was first seen in young. Guanosine (GUO) was able to avoid the decrease in glutamate uptake only in young animals 3h after OGD e also to reduce cell damage in both ages. To study glutamate uptake alterations after OGD in organotypic culture of hippocampal slices, we first standardized this method. There is an increase in glutamate uptake after 1h of reperfusion and a decrease 24h later. Cell death was measured by propidium iodide incorporation and it was significative increased from 13h. There is a decrease in GLT1 levels 24h after OGD. GUO was able in partially protect cells from death, but not able in recovering glutamate uptake decrease 24h after the insult. Neonatal hypoxia-ischemia (HI) was the in vivo model used here. There was an increase in glutamate uptake 24h after the insult in the ipsilateral hemisphere and a decrease 72h later in both hemispheres. GFAP and S100B alterations were also analyzed. There was an increase in GFAP levels dependent of age in all times studied and in both structures. In the HI group, the increase of GFAP was significatively higher in the ipsilateral hemisphere and this was different from its control 48 and 72h after the insult. There was an increase in S100B levels dependent of age in cortex, without difference between control and HI group. In the ipsilateral hippocampus, there was an increase of S100B dependent of time in HI and HI-GUO group, but only HI-GUO was different from its control 48 and 72h after the insult. GUO had no effect over glutamate uptake in cortex, GFAP levels in both structures, and S100B in córtex. APDC, a potent agonist of methabotropic receptors of grup II, was tested in the same OGD model used in the first chapter. APDC was able in partially avoid glutamate decrease induced by OGD in hippocampal slices, and this effect was abolished by APICA, a group II antagonist. These results are preliminary and deserve more study. We could conclude that when different experimental models are used, as in vitro or in vivo, these could give us distinct date about the same parameter or about the same drug in study, and even that happens, they are very important since each model might represent a complete different situation.