Quantificação de ferro em tecido hepático através de espectroscopia por absorção atômica : validação do método com fígado bovino e avaliação comparativa entre tecido fresco e tecido conservado em parafina

Abstract

A determinação da concentração de ferro hepático (CFH) possui importantes implicações no diagnóstico clínico e na pesquisa dos estados de sobrecarga de ferro. O método de escolha para a quantificação de ferro hepático é a espectroscopia por absorção atômica (EAS), e a sua disponibilidade é restrita a centros de referência. Geralmente, são utilizados fragmentos de tecido hepático fresco obtidos por biópsias. Uma alternativa de grande interesse na prática clínica é a utilização de tecido conservado em parafina. O presente estudo teve como objetivos desenvolver e validar uma metodologia para a quantificação de ferro no tecido hepático através da EAS, e comparar a CFH em amostras de tecido hepático fresco e naquelas conservadas em parafina. A pesquisa foi desenvolvida em duas fases. Primeiramente, foram feitos experimentos para a validação do método, utilizando solução-padrão de ferro e padrão de referência para fígado bovino, do National Institute of Standards and Technology (NIST). Foram avaliados os seguintes parâmetros analíticos, seguindo-se as diretrizes de validação da International Conference on Harmonization (ICH): linearidade, exatidão e precisão (repetibilidade de injeções, precisão intra-dia e entre-dias). A 2ª fase consistiu em um estudo comparativo entre a CFH em tecido hepático bovino fresco liofilizado e tecido conservado em parafina; os fragmentos foram obtidos por biópsias "em cunha". As análises bioquímicas foram realizadas por espectrofotômetro de absorção atômica Perkin- Elmer, modelo Analyst-300, com forno de grafite. Os resultados observados mostraram uma excelente linearidade do método para a faixa de concentração entre 20 e 120 ppb, obtendo-se um coeficiente de determinação médio de 0,99. O desvio-padrão relativo (DPR) foi inferior a 15% para a exatidão, e inferior a 10% para a precisão entre-dias e para a precisão intra-dia. A precisão da repetibilidade de injeções foi 0,65%. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre os valores da CFH nos grupos de tecido hepático fresco e de tecido conservado em parafina (p=0,2). Os achados do presente estudo permitem concluir que a quantificação de ferro no tecido hepático encontra-se validada, e que é possível realizar este método utilizando tecido hepático bovino fresco liofilizado. Além disso, a comparação entre a CFH em fragmentos de tecido hepático fresco e em amostras desparafinadas permite concluir que o método pode ser utilizado de forma confiável e reprodutível para a quantificação de ferro hepático em amostras estocadas em bloco de parafina.

Determination of hepatic iron concentration (HIC) has important diagnostic and research implications on iron overload states. Atomic absorption spectroscopy (AAS) is considered the method of choice, and it is only available in selected institutions. Usually, measurement of hepatic iron content is performed on fresh tissue. An important practical issue is the possibility to use paraffin-embedded tissue for this purpose. The objectives of this study were to validate hepatic iron quantitation by AAS at our setting in Brazil, and to compare HIC between fresh and paraffin-embedded tissue. The study was performed in two different phases. First, method validation was performed using the National Institutes of Standards & Technology standard reference material 1577b (bovine liver), following the guidelines of the International Conference on Harmonization (ICH). Bioanalytical procedures were performed to evaluate linearity, precision and accuracy. Biochemical analysis were performed at a Perkin-Elmer spectrometer, model Analyst-300, with graphite-furnace. In the second phase of the study, surgical biopsy samples were obtained from bovine liver and divided in two different groups (fresh tissue or paraffin-embedded tissue) for further measurement of hepatic iron content. We found an excellent correlation on the method's linearity for the concentration range between 20 and 120 parts per billion (ppb) - average r² = 0,99. The relative standard deviations (RSD) were bellow 15% for accuracy, and below 10 % for both day-to-day reproducibility and within-days precision. HIC values were similar in both fresh and deparaffinized tissue, as analysed by paired Student's t Test (p=0,2). We conclude that the determination of HIC by AAS was validated by the present study, and that it is possible to perform iron quantitation on fresh bovine liver tissue. Comparative analysis also suggest that accurate hepatic iron quantitation of deparaffinized liver tissue is possible at our setting.