Estudos da função e regulação do gene CHI2 do fungo entomopatógeno Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokin (1883)

Abstract

O fungo Metarhizium anisopliae é amplamente estudado como modelo da interação parasita-hospedeiro em nível molecular. Este fungo tem a capacidade de infectar artrópodes suscetíveis de forma direta através de suas cutículas. Para tanto, o fungo, utiliza-se de um processo multifatorial envolvendo pressão mecânica e secreção de hidrolases. Dentre elas, destacam-se as quitinases, envolvidas tanto nos processos de morfogênese do próprio organismo quanto em processos de patogenia e nutrição. Estudos avaliando a expressão de genes possivelmente envolvidos no processo de infecção de hospedeiros ajudam a esclarecer o processo em si. Assim, quitinases são alvos de interesse para estudos de regulação e função. Neste sentido, estratégias para a geração de transformantes que não expressem ou que expressem genes em níveis aumentados são utilizados e aplicados em trabalhos deste e de outros grupos de pesquisa a fim de determinar-se o papel de genes em determinados processos. Este trabalho envolve o estudo do gene chi2, que codifica para uma quitinase (CHI2) de 42 kDa, cuja seqüência fora previamente caracterizada. Inicialmente, análises de regulação demonstraram que este gene é altamente regulado dependendo da fonte de carbono disponibilizada. Para estudar a função da quitinase CHI2, foram gerados mutantes nulos para o gene chi2 (chi2) utilizando-se transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens (ATMT), com taxa de recombinação homóloga dentre os transformantes de 1,3%. Experimentos de Western blot demonstraram a ausência de expressão de CHI2 nos transformantes. Assim como para a deleção, a superexpressão de chi2 (T33) foi realizada por Agro-transformação e análises de Western blot demonstraram a expressão aumentada e não regulada de CHI2. Bioensaios utilizando o inseto Dysdercus peruvianus demonstram diferenças de tempo letal mediano e tempo letal 90% (TL50 e TL90) entre as linhagens transformantes e selvagem, sendo maiores para o mutante sem expressão de chi2 22 e menores para o transformante superexpressando chi2 T33. Para avaliar a localização celular de CHI2, antisoro foi produzido em coelhos. Análises de microscopia óptica de imunofluorescência demonstraram diferenças marcantes na distribuição da enzima entre as linhagens selvagem e transformadas. Na linhagem selvagem, em hifas diferenciadas em apressório, a proteína encontra-se associada à parede celular, nas regiões de germinação do esporo, na extremidade da hifa, exatamente no ponto de formação do apressório e em todo o apressório, mas ausente no citoplasma e nos esporos. Já em hifas não diferenciadas, CHI2 apresenta-se associada à parede, mas sem pontos específicos e, portanto, difusa no citoplasma. Este fato evidencia possível rota de secreção. As linhagens deletadas não apresentaram fluorescência, indicando a ausência da proteína, sem nenhuma alteração fenotípica aparente. Portanto, CHI2 não teria papel na morfogênese. Linhagens superexpressando CHI2 não demonstraram localização específica de CHI2, cuja fluorescência foi mais intensa e difusa pela célula. Nestas linhagens, a quitinase CHI2 também pode ser detectada na parede celular dos conídios. Nenhuma alteração morfológica aparente foi detectada nos mutantes de superexpressão. Além disso, o gene chi2 sofre processos diferenciais de splicing, gerando duas espécies de transcritos. Uma delas é totalmente processada e outra retém o segundo íntron, como demonstrado por ensaios de Northern blotting. Demonstramos por ensaios de Western blot em géis SDS-PAGE-2D e espectrometria de massas que as duas proteínas diferentes são traduzidas a partir destes transcritos. Em trabalhos posteriores, transformantes carregando deleção ou superexpressando as diferentes formas poderão auxiliar no entendimento da função das formas de chitinase geradas e contribuirão para o conhecimento mais aprofundado da função das endoquitinases nos processos celulares.

Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokin (1883) is a filamentous fungi widely studied as a model for host-parasite interactions on its molecular basis. This fungus has the ability to infect susceptible arthropods in a direct manner through the host cuticle. The fungus uses a complex process involving mechanic pressure and secretion of hydrolases, among them chitinases, which act either in morphogenesis processes as in pathogenesis and nutrition. Studies that evaluate the expression of genes possibly involved in the pathogenesis process may aid to clarify the process itself. Thus, chitinases genes become the aim for regulation, deletion and overexpression studies. Strategies for generating transformants lacking or overexpressing genes in levels above wild strains are currently being used and already applied in researches of our and other groups. This work involves the study of the chi2 gene, of which sequence has been already characterisized and codes for a 42 kDa chitinase (CHI2). Initially, regulation analysis showed that this gene is tightly regulated depending on the carbon source. The null chi2 mutants (chi2) were constructed by Agrobacterium tumefaciens mediated transformation (ATMT) and the homologous recombination rate was 1.3%. Western blotting assays demonstrated no CHI2 expression by the null transformants. The overexpression of chi2 (T33) was performed using ATMT and Western blotting analysis demonstrated non regulated high levels of CHI2 expression. Bioassays using the cotton stainer bug Dysdercus peruvianus demonstrated distinct TL50 and TL90 values among the wild and modified strains, which were higher for chi2 and lower for T33. In order to evaluate the cellular localization of CHI2, antiserum was produced in rabbits. Optical imunomicroscopy assays demonstrated significantly differences in the enzyme distribution among the wild and transformed strains. In the wild strain, in apressorium differentiated hyphae, the protein is associated with the cell wall, at the germination spot of the conidia, at the distal extremity of the hyphae, exactly at the apressorium formation spot, all over the apressorium and absent at the cytoplasm and conidia. In non differentiated hyphae, CHI2 is also associated with the cell wall, without specific locations and diffused throughout the cytoplasm. Possibly, CHI2 is addressed to secretion. The null strains did not present fluorescence as expected, confirming the absence of the protein, but no morphological alterations were observed. The CHI2 overexpressing strains did not show specific location for CHI2 protein, and the fluorescence reached higher levels and diffused through the cell. Also, CHI2 was detected at the conidia cell wall. No apparent morphological changes were detected in both CHI2 null and overexpressing strains. Thus, CHI2 do not have a role in morphogenesis. It was also observed that this gene presents different patterns of splicing, generating two transcript species. One of them is completely processed, while a second one retains a 72 base pairs intron, as demonstrated by Northern blotting assays. Mass spectrometry demonstrated the synthesis of two different proteins from the transcripts. In future works, transformants carrying deletions or overexpressing the distinct forms of the protein will provide new insights about their function and will improve the knowledge about the overall function of endochitinases throughout the cell development.