Caracterização molecular da enzima heparinase II de flavobacterium heparinum através de simulações de dinâmica molecular

Abstract

A hemostasia envolve diversos eventos fisiológicos desencadeados após a ruptura da integridade vascular. Durante estes processos, os glicosaminoglicanos, incluindo a heparina e o heparan sulfato, desempenham funções fisiológicas fundamentais. Particularmente a heparina, isolada no início do século XX, permanece até os dias atuais como um dos mais eficientes agentes terapêuticos de ação antitrombótica. As cadeias polissacarídicas destes glicosaminoglicanos são clivadas por liases, denominadas heparinases, através de um mecanismo de eliminação. As heparinases, identificadas inicialmente na bactéria do solo Flavobacterium heparinum (sinonímia: Pedobacter heparinus), diferem em tamanho, carga e grau de especificidade pela sequência dissacarídica do substrato. Possuem importantes aplicações na terapêutica, diagnóstico e também na produção de heparinas de baixo peso molecular (HBPM). Dentre as heparinases já descritas para F. heparinum a enzima do tipo II é a menos específica, sendo capaz de clivar ligações glicosídicas do tipo 1-4 entre a glicosamina e ácido urônico (idurônico ou glicurônico), presentes na heparina e no heparan sulfato. Entretanto, o processo de reconhecimento enzima-substrato neste sistema é ainda pouco conhecido. Particularmente com relação à dependência por metais, esta enzima tem sua atividade inibida pela presença do íon cálcio que, em contrapartida, é importante para a atividade das heparinases dos tipos I e III. A heparinase II é uma glicoproteína e apresenta um sítio de ligação ao íon zinco, o qual exerce uma importante função de manutenção da integridade da estrutura protéica. Desta forma, o presente trabalho tem por objetivo a caracterização estrutural e conformacional da enzima heparinase II e, a partir destas informações, subsidiar o entendimento do reconhecimento e especificidade da interação enzima-substrato, fundamentando um planejamento racional de novos ligantes. Empregando-se a Dinâmica Molecular (MD), quatro sistemas envolvendo a enzima foram estudados, considerando-se a presença ou ausência de íons Ca+² e Zn+² e da estrutura de glicosilação. Os dados obtidos indicam que a presença do íon Zn+² pode estar envolvida no controle da flexibilidade da estrutura protéica em regiões específicas da heparinase II. Em contrapartida, a presença do íon Ca+² promove um acréscimo significativo na flexibilidade em regiões equivalentes àquelas do Zn+², relacionada à influência do íon no sítio catalítico da enzima. Adicionalmente, a presença da O-glicosilação parece ser capaz de promover uma estabilização adicional da estrutura secundária da proteína, sugerindo um papel na estabilidade conformacional da mesma. Globalmente, os resultados indicam que simulações de MD podem ser utilizadas para representar adequadamente a conformação de glicoproteínas como a heparinase II, permitindo a caracterização de diversas propriedades, como a quantificação de suas interações com cofatores metálicos e o papel de seu sítio de glicosilação. Cria-se, portanto, uma sólida base para o estudo das demais heparinases, de suas respectivas especificidades e, por fim, para o planejamento racional de novos candidatos a agentes moduladores dos processos hemostáticos.

The hemostasis comprises important physiologic events following the rupture of vascular integrity. During these processes, heparin and heparan sulfate glycosaminoglycans (HSGAG) presents important physiological functions. In particular heparin, isolated in the beginning of the XX century, remains until today as one of the most efficient antithrombotic therapeutic agents. The polysaccharide chains of these HSGAGs are cleaved by lyases, named heparinases, through an elimination mechanism. The heparinases, first identified in the soil bacterium Flavobacterium heparinum (also named Pedobacter heparinus), differ in size, charge and substrate specificity. They have important applications, such as therapeutic, diagnostic and production of low molecular weight heparins (LMWH). Within the heparinases from F. heparinum, the type II enzyme has the broadest substrate specificity, being capable of cleavage upon the (1-4) glycosidic linkages between glucosamine and uronic acid (either glucuronic or iduronic) residues contained by heparin and heparan sulfate. However, the enzyme-substrate recognition process is poorly structurally described. Mainly in relation of the metals dependence, this enzyme has its activity inhibited by the presence of the calcium ion which, in opposite, is important for heparinanses I and III activities. The heparinase II is a glycoprotein and shows a zinc ion binding site, which plays an important role in the protein structure maintenance. Thus, the current work aims to characterize the structure and conformation of heparinase II enzyme and, based on this information, support the understanding of the recognition and specificity of the enzyme-substrate interaction, and further the rational design of new ligands of the enzyme. Using molecular dynamics (MD) calculations, four systems were studied, considering the presence or absence of Ca+² and Zn+² ions and the glycosylation structure. The obtained data indicates that the presence of a Zn+² ion may be involved in the control of the protein flexibility at some specific regions of the heparinase II. In opposite, the Ca+² presence promotes a significant increase of the flexibility on the same regions, related to the influence of this ion in the enzyme active site. Additionally, the O-glycosylation seems to be capable to promote an additional stabilization of the protein secondary structure, what may indicate its role as an element that contributes to the conformational stability of the protein. Altogether the results show that MD simulations can be used to correctly represent the glycoprotein conformations, such as heparinase II, allowing characterizing its properties, as well as quantifying its interactions with metallic cofators and the role of the glycosylation site. Thus, is generated a solid basis to the study of the other heparinases, their respective specificities, and finally to the design of new candidates to hemostatic process modulating agents.