Sêmen da cauda do epidídimo de garanhões submetido à centrifugação com coloide

Abstract

A coleta de sêmen da cauda do epidídimo é a última oportunidade de obter espermatozoides de garanhões valiosos, sendo que durante a criopreservação, a etapa de centrifugação é considerada um ponto crítico. A principal hipótese é que a centrifugação com coloides pode melhorar a qualidade dos espermatozoides coletados da cauda do epidídimo de garanhões. Para avaliação da hipótese foram realizados dois experimentos. O experimento um teve por objetivo avaliar o efeito da centrifugação com cushion e com coloide em camada única (SLC) na motilidade de sêmen do epidídimo de garanhões após a etapa de centrifugação. O experimento dois teve o objetivo de determinar o efeito da SLC prévio ao congelamento e após o descongelamento. Experimento 1) Oito garanhões foram submetidos à orquiectomia bilateral e o sêmen foi coletado da cauda dos epidídimos (n=16). Após a coleta, as amostras foram submetidas a três protocolos de centrifugação: Convencional (20 minutos a 600xg), cushioned (20 minutos a 900xg) e SLC (20 minutos a 300xg). Os pellets foram ressuspendidos e as amostras foram submetidas à avaliação laboratorial de motilidade e morfologia espermática. Experimento 2) Dez garanhões foram submetidos a orquiectomia bilateral e o sêmen foi coletado da cauda dos epidídimos (n=20). Para criopreservação, as amostras foram submetidas a: centrifugação convencional (20 minutos a 600xg), SLC prévio a criopreservação (SLC-Pre) (20 minutos a 300xg) e SLC após a criopreservação (SLC+) (20 minutos a 600xg seguidos de uma segunda centrifugação descrita após descongelamento). Os pellets foram ressuspendidos em diluente de congelamento, submetidos ao processo de congelamento em nitrogênio líquido e descongelamento. Os grupos de 6 centrifugação convencional e SLC-Pre foram avaliados imediatamente após descongelamento. O grupo SLC+ foi descongelado e submetido à SLC (20 minutos a 300xg) e ressupendido em diluente de congelamento (SLC+F) ou resfriamento (SLC+C). A motilidade total e a motilidade progressiva das amostras foram avaliadas com análise computadorizada do movimento espermático. A morfologia foi avaliada com auxílio de microscópio com contraste de fase. Funcionalidade de mitocôndria, integridade de membrana e DNA foram avaliados com auxílio de microscópio de fluorescência. Os dados foram analisados por estatística descritiva, simple one-way ANOVA e Teste de Tukey. Experimento 1) a motilidade de espermatozoide submetidos à SLC (p<0,05) e cushion (p>0,05) foi superior do que os submetidos a centrifugação convencional. Experimento 2) SLC-Pre e SLC+F apresentaram maior motilidade total, enquanto SLC+F apresentou maior motilidade progressiva. O percentual de espermatozoides com morfologia normal foi maior em SLC-Pre e SLC+F. A funcionalidade de mitocôndria foi maior em todos grupos com SLC, enquanto a integridade de membrana foi maior em SLC-Pre. A centrifugação com coloides melhorou a qualidade de espermatozoides coletados da cauda do epidídimo de garanhões, tanto no momento prévio ao congelamento como após o descongelamento.

Epididymis cauda sperm recovery and cryopreservation are last opportunity to obtain spermatozoa from a valuable animal, even though during cryopreservation centrifugation step is considered as a critical point. It is hypothesized that colloidal centrifugation could enhance epididymal stallion sperm parameters. To evaluate this hypothesis two experiments were performed. In experiment one, the objective was to evaluate the effect of cushioned and Single Layer Centrifugation (SLC) on epididymal stallion sperm motility postcentrifugation. In experiment two, the objective was to determine the effect of SLC on epididymal stallion sperm quality pre-freezing and post-thawing. Experiment 1) Eight stallions were submitted to bilateral orchiectomy and the resulting epididymal cauda (n = 16) were flushed with semen extender. After harvesting, samples were submitted to three centrifugation protocols: conventional (20 minutes at 600xg), cushioned (20 minutes at 900xg), and SLC (20 minutes at 300xg). Pellets were resuspended, motility and morphology were evaluated. Experiment 2) Ten stallions were submitted to bilateral orchiectomy and epididymal cauda (n=20) were harvested. For cryopreservation, epididymal sperm were submitted to: conventional centrifugation (20 minutes at 600xg), Single Layer Centrifugation prior cryopreservation (SLC-Pre) (20 minutes at 300xg) and Single Layer Centrifugation after cryopreservation (SLC+) (20 minutes at 600xg followed by a second centrifugation described after thawing). Pellets were resuspended in freezing extender, submitted to cryopreservation process in liquid nitrogen and thawed. Conventional and SLC-Pre were evaluated immediately after thawing. SLC+ samples were thawed, submitted to SLC (20 minutes at 300xg) and the pellets were resuspended with freezing (SLC+F) and cooling extender (SLC+C). Total motility (TM) and progressive 8 motility (PM) were evaluated with computer-assisted semen analyses. Sperm morphology was evaluated under a phase-contrast microscope. Mitochondrial functionality, membrane e DNA integrity were evaluated with an epifluorescence microscope. Data was evaluated by descriptive statistics, simple one-way ANOVA and comparison between means by Tukey test. Significance was assigned to all values p<0.05. Experiment 1) Motility of spermatozoa recovered by SLC (p<0.05) and cushioned centrifugation (p>0.05) were higher than those recovered by conventional centrifugation. Experiment 2) SLC-Pre and SLC+F yielded the highest TM, while SLC+F yielded the highest PM. Higher morphological normal sperm was observed in SLC-Pre and SLC+F. Mitochondrial functionality was significantly higher in all treatments with SLC, while membrane integrity was higher in SLC-Pre. Colloidal centrifugation improved epididymal sperm quality before freezing and after thawing.