Potenciais receptores de Anthonomus grandis Boheman (coleoptera: curculionidae) para toxinas cry de Bacillus thuringiensis Berliner

Abstract

As toxinas Cry de Bacillus thuringiensis apresentam atividade inseticida e alto grau de especificidade a certos grupos de insetos, sendo inócuas para vertebrados. Estas características vêm sendo utilizadas no desenvolvimento de plantas geneticamente modificadas para o controle de pragas. O inseto-praga de maior importância na cotonicultura brasileira é o bicudo do algodoeiro (Anthonomus grandis), inseto de hábitos larvais endofíticos, e, por isso, de difícil controle. O objetivo deste trabalho foi identificar os prováveis receptores deste inseto para toxinas Cry. O gene para a toxina Cry8Ka1 foi clonado e um mutante com alta toxicidade foi obtido pelas técnicas de DNA Shuffling e Phage Display. Este mutante, Cry8Ka5, foi utilizado para identificação dos receptores. Experimentos de ligação realizados após SDS-PAGE indicam que as toxinas Cry1Ac, Cry8Ka1 e Cry8Ka5 marcadas com biotina são capazes de ligação às mesmas proteínas presentes no epitélio intestinal do inseto. Destas, uma HSP70 cognate e uma V-ATPase, foram identificadas via seqüenciamento de novo, enquanto um ligante de ~120kDa não pôde ser identificado. Cinco spots capazes de reconhecimento pela Cry8Ka5 foram identificados em 2DE, demonstrando capacidade de ligação a diferentes isoformas ou a proteínas apresentando modificações pós-translacionais. Como Cry1Ac não é tóxica para A. grandis e é capaz de ligação às mesmas proteínas, um bioensaio foi conduzido com o objetivo de validar o papel funcional dos ligantes. Foram feitos quatro tratamentos: 1) Controle negativo (H2O); 2) Cry1Ac; 3) Cry8Ka5; 4) Cry8Ka5+Cry1Ac. Apenas o tratamento 3 diferiu estatisticamente dos demais, indicando que a ligação de Cry1Ac a estas proteínas bloqueia o mecanismo de ação de Cry8Ka5.

The Cry toxins from Bacillus thuringiensis display insecticidal activity and are highly specific to certain groups of insects, being harmless to vertebrates. These characteristics have been used to the development of genetically modified plants to control economically important insect-pests. The insect pest of major importance in the Brazilian cotton culture is the cotton boll weevil (Anthonomus grandis), insect of endophytic larval habits, and therefore difficult to control. The aim of this work was to identify putative receptors of this insect to Cry toxins. A gene for Cry8Ka1 toxin was cloned and a mutant with high toxicity against A. grandis was obtained by DNA Shuffling and Phage Display techniques. This mutant, called Cry8Ka5, was used to identify the receptors. Ligand blot experiments performed after SDS-PAGE indicated that biotin-labeled Cry1Ac toxin (not toxic to A. grandis), Cry8Ka5 and Cry8Ka1 are able to recognize the same proteins from the midgut of A. grandis. Two of them, a HSP70 cognate and a V-ATPase were identified by de novo sequencing, whereas a ~120kDa protein was not identified. The characterization of these proteins via two-dimensional gel electrophoresis revealed the presence of five spots capable of binding to Cry8Ka5, demonstrating its ability to recognize different isoforms or showing post-translational modifications. As Cry1Ac is not toxic to A. grandis and is able to bind to the same proteins, a bioassay was conducted to evaluate the functional role of the ligands. Four treatments were conducted: 1) negative control (H2O); 2) Cry1Ac, 3) Cry8Ka5 4) Cry8Ka5 + Cry1Ac. Only treatment 3 presented statistical difference, indicating that the Cry1Ac binding to these proteins blocks Cry8Ka5 mechanism of action.