Desenvolvimento de um método molecular colorimétrico para detecção e genotipagem do vírus da Hepatite C

Abstract

O diagnóstico laboratorial do Vírus da Hepatite C (HCV) pode ser realizado através de análises sorológicas ou por técnicas de biologia molecular. Os testes moleculares são divididos em qualitativos, quantitativos e de genotipagem. Esses são utilizados para confirmação diagnóstica, escolha da terapia antiviral e monitoramento do tratamento. Diversos testes moleculares comerciais estão disponíveis no mercado, no entanto, limitações como o custo elevado, alta complexidade e falta de validação são impeditivos para sua ampla utilização no país. Em razão das dificuldades citadas, novos métodos moleculares têm sido propostos como alternativa. Sendo assim, o presente estudo teve como objetivo o aprimoramento de um método in house para extração e purificação do RNA de HCV, bem como sua detecção qualitativa e genotipagem, utilizando hibridização em microplacas do produto de PCR biotinilado, seguido de detecção colorimética. A região 5'-NCR do HCV foi escolhida para a amplificação. Para avaliar a eficiência do método colorimétrico de hibridização reversa (MCHR) proposto, os resultados foram comparados com os métodos de referência para detecção qualitativa e genotipagem do HCV. Entre as 85 amostras de plasma analisadas, a sensibilidade e especificidade do MCHR para detecção do RNA viral, quando comparado com Cobas Amplicor HCV Assay v2.0, foram de 100% (95% IC; 92,75% - 100%) e de 97,2% (95% IC; 85,48% -100%), respectivamente. Os valores preditivo positivo e preditivo negativo foram de 98% (95% IC; 89,36% - 99,95%) e de 100% (95% IC; 90,01% - 100%), respectivamente. O Kappa encontrado foi de 0,976 (p < 0,001), mostrando alto grau de concordância entre os dois métodos de detecção qualitativa. Para genotipagem do HCV, pôde-se observar 97,22% (35/36) de concordância entre o MCHR e o seqüenciamento de DNA. O Kappa encontrado foi de 0,976 (p < 0,001), mostrando alto grau de concordância entre os dois métodos de genotipagem. Sendo assim, o método proposto apresentou bons resultados de sensibilidade e especificidade, com alto grau de concordância com os métodos de referência, tanto para detecção qualitativa, como para genotipagem do HCV.

The tests for HCV diagnosis are divided into serological and molecular assays. The molecular assays are used to confirm viremia, choice of antiviral therapy and monitor the response to antiviral therapy. A variety of commercial molecular assays have been developed, however, limitations such as the high cost, high complexity and lack of validation impede its widespread use, especially in developing countries. Because of the difficulties cited above, new molecular biology techniques have been proposed as alternatives. Thus, this study aimed at the improvement of an in house method for extraction and purification of RNA from HCV as well as its qualitative detection and genotyping, using hybridization in microplates of biotin-labeled PCR products, followed by colorimetric detection. The region of HCV 5'-NCR was chosen for the amplification. To evaluate the efficiency of colorimetric microwell hybridization assay (CMHA), the results obtained were compared with the reference methods. Among the 85 plasma samples analyzed, the sensitivity and specificity of CMHA for viral RNA detection, when compared with Cobas Amplicor HCV assay v2.0, were 100% (95% CI, 92.75% - 100%) and 97.2% (95% CI, 85.48 % -100%), respectively. The positive predictive and negative predictive values were 98% (95% CI, 89.36% - 99.95%) and 100% (95% CI, 90.01% -100%), respectively. The calculated Kappa was 0.976 (p <0001), showing high correlation between the two methods. Similarly, it was observed 97.22% (35/36) of agreement between the DNA sequencing data and MCHR, for HCV genotyping. The Kappa values was 0.976 (p <0001), showing high correlation between the two methods. The proposed method showed good sensitivity and specificity, with a high degree of concordance between the reference methods for both qualitative detection and for genotyping of HCV.